葡萄籽多肽的制备及其抗氧化活性

尹佳，胡金德，王丽华，邓明慧，黄志鸿，李继锋

吉林化工学院生物与食品工程学院（吉林 132022）

葡萄籽占鲜果质量的4%～7%，其含有丰富的脂类、多酚类和蛋白质类化学物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射和保护心血管等药理学活性功能[1]。葡萄籽中存在可观的葡萄籽蛋白，与葡萄籽蛋白相比，葡萄籽多肽具有更高的营养价值，具有抗氧化性、乳化稳定性、抑菌性、免疫调节以及抗肿瘤等多种活性[2-3]。因而，研究葡萄籽多肽及其生物活性，既能提升葡萄籽蛋白质资源利用价值，也能增加食品的多样化。

此次试验选取木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对葡萄籽蛋白进行酶解，通过单因素试验，利用正交试验分析方法，以葡萄籽多肽得率为响应优化值，确定最佳工艺参数。根据清除DPPH自由基的能力和对铁离子还原能力的测定，分析葡萄多肽的抗氧化活性。多肽是葡萄籽重要的活性成分之一，建立经济有效的葡萄籽多肽提取方法，可为其应用于保健食品、生物制剂及医药品等相关产品的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄籽蛋白粉（实验室自制）[4]、碱性蛋白酶（＞200 U/mg）、木瓜蛋白酶（＞600 U/mg）、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白（BSA）、DPPH（1,1-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、95%乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、铁氰化钾、氯化铁，以上试剂均为国产分析纯。

JA-503分析电子天平（天津精拓仪器设备有限公司）；DDL-5M离心机（济南博鑫生物技术有限公司）；HWS-24电热恒温水浴锅（上海一恒仪器设备有限公司）；PSH-25型酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；PR-5旋转蒸发器（南通普瑞科技仪器有限公司）；UV-1800紫外分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）；FD-2A真空冷冻干燥机（上海继普仪器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽多肽的制备[5]

葡萄籽蛋白粉→溶解加热（75 ℃，45 min）→葡萄籽蛋白溶液→调节pH→加酶→酶解液灭酶（90℃，20 min）→离心（4 000 r/min，20 min）→真空冷冻干燥→多肽冻干粉

1.2.2 单因素试验

根据相关研究报道，蛋白酶解过程受复合酶的配比、酶的添加量、酶解时间、酶解温度、酶解pH的影响[6-7]。因此，考察复合酶的配比（碱性蛋白酶-木瓜蛋白酶1∶4，2∶3，1∶1，3∶2和4∶1）、酶的添加量（酶底质量百分比1%，1.5%，2%，2.5%和3%）、酶解时间（1，2，3，4和5 h）、酶解温度（45，50，55，60和65 ℃）、酶解pH（6.5，7.0，7.5，8.0和8.5）对葡萄籽多肽得率的影响，分别进行单因素试验，以确定最佳的因素水平。

1.2.3 酶解液中总蛋白含量测定

参照祝婧等[8]方法。取1 mL酶解上清液于10 mL试管中，再加入5.0 mL 0.01%考马斯亮蓝G-250染液；空白组用蒸馏水作对照，混合均匀，静置5 min，在595 nm波长下测定酶解液的吸光度；以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线（图1），根据标准曲线得到酶解液中总蛋白质含量。回归方程为y=0.084 1x+0.000 8（R2=0.997 5），线性关系良好。

图1 牛血清白蛋白标准曲线

1.2.4 肽得率的测定

参照王雪峰等[9]方法。取5 mL酶解上清液测定其蛋白质含量；另取5 mL酶解上清液，加入5 mL 20%三氯乙酸溶液，摇匀，静置30 min，以4 000 r/min离心20 min，取上清液测定肽得率。

1.2.5 多肽清除DPPH·清除能力测定[10]

配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液与不同浓度梯度的多肽溶液；分别量取2 mL多肽溶液，与2 mL DPPH·乙醇溶液混合均匀，之后在避光处静置30 min；在517 nm波长下测定混合溶液的吸光度，并按式（2）计算DPPH·清除率。

式中：A1为DPPH·乙醇溶液+葡萄籽多肽液的吸光度；A2为95%乙醇+葡萄籽多肽液的吸光度；A3为DPPH·+蒸馏水的吸光度。

1.2.6 多肽对铁离子还原能力的测定[11]

取一定量的葡萄籽多肽，加入3.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混合均匀，在50 ℃水浴中反应25 min。再各自加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀后于4 000 r/min离心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%FeCl3溶液，混匀，静置10 min，在700 nm波长处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 复合酶的配比对肽得率的影响

由图2可知，当复合酶的质量比为碱性蛋白酶-木瓜蛋白酶3∶2时，蛋白多肽得率达到67.38%，当加入复合酶时，蛋白多肽被分解为相对分子质量更小的多肽和氨基酸，因此效果最佳[12]。

2.1.2 酶添加量对肽得率的影响

由图3可知，蛋白发生酶解时随着酶添加量的增加，多肽得率呈增加趋势。当加酶量达到2.5%时，多肽得率增加趋缓。这是因为底物与酶的接触面积趋于饱和，再增加酶用量反而由于大分子之间的位阻等作用抑制了酶促反应的进行[13]。因此最佳酶添加量为2.5%，这样既不增加复合酶用量成本，又可使葡萄籽蛋白充分水解。

2.1.3 酶解时间对肽得率的影响

由图4可知，肽得率随时间的延长呈现先逐渐增加，再趋于平稳后略有下降趋势。在酶解4 h时，肽得率达到最大。当反应继续进行时，肽得率逐渐平缓。这是由于随着酶解时间的延长，酶解反应中蛋白底物被水解得比较彻底，之后酶解时间继续增加而肽含量并未增加，因此肽得率趋于稳定[14]。故最佳酶解时间选择4 h。

图4 酶解时间对肽得率的影响

2.1.4 酶解pH对肽得率的影响

由图5可知，随着pH的增大，酶解反应速率在增大，肽的含量也在增多，当pH增加至7.5时，肽得率达最大值，随后则随着pH持续增加，肽得率下降。这是因为在酶解反应中，每种酶促反应均会有最适pH，过酸或过碱的环境均会使酶的活性下降，影响反应速率[15]。因此，最适酶解pH为7.5。

图5 酶解pH对肽得率的影响

2.1.5 酶解温度对多肽含量的影响

由图6可知，随着酶解温度的不断升高，多肽得率呈现先升高后下降的趋势。这是因为随着温度的升高，酶活性慢慢增大，酶解的多肽产物增多，肽得率随之增大[16]。但是当温度过高时，酶活性会大大降低，因此酶解的多肽产物减少，肽得率下降。故最佳酶解温度选择50 ℃。

图6 酶解温度对肽得率的影响

2.2 正交试验优化酶解制备工艺

根据单因素试验结果，选定酶解温度（A）、酶添加量（B）、酶解时间（C）、酶解pH（D）为自变量，肽得率为响应值，采用L9(34)正交试验对酶解条件进行优化，结果见表1和表2。

由极差R可知，影响葡萄籽多肽得率的各因素主次顺序为A＞C＞B＞D。因此，酶解温度对葡萄籽多肽得率的影响最大。根据各试验因子的平均数可知，蛋白酶解的最佳组合为A2B2C3D2，即酶解温度50 ℃，酶添加量2.5%，酶解时间5 h，pH 7.5，此时葡萄籽多肽的得率最高。在此最优工艺条件下分别进行3次葡萄籽蛋白酶解试验，葡萄籽多肽得率为78.64%。

2.3 葡萄籽多肽的抗氧化活性

将多肽样品稀释成不同质量浓度进行多肽清除DPPH自由基能力和多肽对铁离子还原能力的测定，结果如图7所示。多肽对DPPH自由基的清除具有一定的作用，在质量浓度0.1～1 mg/mL范围内，多肽对自由基的清除能力随着其浓度的增加而增强。在多肽对铁离子还原能力的测定中，吸光度越大，说明还原力越强，抗氧化活性就越高[17]。由图7可知，随着多肽质量浓度的增大，其还原能力随之增强，所以葡萄籽多肽具有良好的体外抗氧化活性，且与其浓度具有依赖关系。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果表

图7 质量浓度与抗氧化活性的关系

3 结论

此次试验以葡萄籽蛋白粉为原料，考察复合酶的质量比、酶解温度、酶的添加量、酶解时间及酶解pH对多肽得率的影响，并结合正交试验优化了酶法制备葡萄籽多肽的最优工艺条件：pH 7.5，酶解时间5 h，酶添加量2.5%，酶解温度50 ℃，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶质量比3∶2。在此条件下，葡萄籽多肽得率为78.64%。葡萄籽多肽具有良好的体外抗氧化活性，且与其浓度具有依赖关系。此次试验为葡萄籽蛋白活性肽的高效制备及抗菌肽等高附加值产品的研发提供理论依据。