四川传统泡菜中乳酸菌分离与鉴定

李玉德，黄庆才

(米易华森糖业有限责任公司，四川攀枝花 617200)

0 引言

四川泡菜是优质中国泡菜的代表[1]，具有鲜、香、嫩、脆和甜的特点。是四川人民餐桌上的一道重要的小菜.传统的泡菜制作工艺是以新鲜蔬菜为原料，经过择菜、洗菜、切分与晾干，加食盐水和老泡菜水，腌渍发酵制作而成，腌渍过程中通过加入食盐形成高渗环境抑制有害微生物生长，蔬菜表面和老泡菜水中以乳酸菌为主的有益菌在发酵过程逐渐形成优势[2]，促进泡菜风味的形成.传统工艺完全依赖经验，品质不稳定，质量难以保证，且常出现亚硝酸盐超标、腐败菌和病源菌引起的食品安全问题.一直以来，泡菜中的亚硝酸盐问题是消费者密切关注的的食品安全问题[3].亚硝酸盐能够使血红蛋白氧化生成高铁血红蛋白，导致低氧血症，在体内可转化生成致癌物亚硝胺，导致胃癌、甲状腺癌等疾病[4-5].传统泡菜工业生产与家庭制作均存在着发酵周期长、亚硝酸盐含量不可控等问题.在泡菜发酵前期，细菌的硝酸盐还原酶将硝酸盐转化为亚硝酸盐，导致亚硝峰出现.在发酵后期，随着酸度的升高，乳酸菌中的亚硝酸盐还原酶和产酸协同可迅速降解亚硝酸盐，有机酸降解是亚硝酸盐降解的主要方式[6].在泡菜腌渍过程中进行强化优质乳酸菌，既可以抑制有害菌生长，又可以快速产酸、降解亚硝酸盐，是提升泡菜品质的重要途径[7-9].本研究从传统四川泡菜中分离乳酸菌，对其降亚硝酸盐、产酸性能进行检测，筛选产酸能力与降亚硝酸盐能力强的乳酸菌，从而为工业化生产提供优质乳酸菌.

1 材料与方法

1.1 样品采集

采用无菌方法，在采用传统方法制作的优质泡菜中取得泡菜水，密封保存于4℃冰箱，24 h内开展后续实验.

1.2 实验药品

葡萄糖、三水合乙酸钠、柠檬酸氢二胺、四水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80、溴甲酚绿、氯化钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、盐酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠，均为分析纯；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂均为生物试剂.

1.3 培养基

1.3.1 MRS液体培养基 葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，三水合乙酸钠5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，四水磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁2.0 g，硫酸锰0.05 g，吐温801.0 mL，调节pH至6.2～6.6，定容至1 000 mL，121℃灭菌20 min.

1.3.2 MRS固体培养基 MRS液体培养基的基础上，以1 000 mL添加20 g琼脂，调节pH至6.2～6.6，121 ℃灭菌20 min.

1.3.3 乳酸菌鉴别培养基 在MRS固体培养基的基础上，另加0.01%溴甲酚绿作指示剂.

1.4 仪器和设备

超净工作台(江苏苏净)、高压灭菌锅(上海申安)、恒温培养箱(上海一恒)、紫外可见分光光度计(北京普析)、酸度计(上海雷磁)、电子天平(上海舜宇).

1.5 乳酸菌的分离与纯化

将泡菜水解冻后在无菌条件下取1mL于无菌试管中，再用无菌生理盐水做稀释梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7.用移液枪分别取10-5、10-6、10-7各0.2 mL涂布到乳酸菌鉴别培养基上，再将培养基放置在干燥器中，盖上盖子，通过点蜡烛燃烧消耗氧气，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养.培养72 h后，取出培养基，挑出让培养基变色的菌种，用划线接种法接种到新的乳酸菌鉴别培养基上，如此反复，直到分离纯化出纯菌落，此时的菌种初步鉴定为乳酸菌，并对菌株进行编号.将筛选出的乳酸菌用划线法接种到乳酸菌鉴别培养基上，在37 ℃恒温条件下培养48 h后观察其菌落在固体培养基中生长情况及形态、大小.

1.6 产酸能力测定

将经过分离、纯化的菌种接种到20 mL的MRS液体培养基中，在37 ℃培养箱中恒温灭氧培养18 h，再以1%的接种量接种到150 mL的液体MRS培养基中，每隔12 h用pH计测pH值.

1.7 降亚硝酸盐能力检测

1.7.1 亚硝酸盐标准曲线 根据参考文献[10]中的分光光度法，绘制标准曲线如图1所示，亚硝酸钠浓度(μg/mL)与吸光度之间的线性方程为y=0.013 8x+0.011 2(R2=0.999 6)，呈良好的线性关系.

图1 亚硝酸盐标准曲线Fig.1 standard Curve of Nitrite

1.7.2 乳酸菌的亚硝酸盐降解率测定 从MRS固体培养基上挑取单菌落接种到20 mL MRS液体培养基中，在37℃恒温条件下培养18 h(菌种处于对数生长期)，将活化后的菌悬液以1%的接种量接种到100 mL含有20 mgNaNO2(质量浓度为200 μg/mL)的灭菌的MSR液体培养基中，于37 ℃恒温条件下培养48 h，依据参考文献5中的分光光度法测定发酵液中的亚硝酸盐含量(X)，计算亚硝酸盐降解率.

1.8 分子生物学鉴定

将分离获得的乳酸菌接种到液体MRS培养基中活化16 h，吸取1.5 mL菌液于1.5 mL离心管中，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA，冷冻保存，参照文献[2]扩增细菌16S rDNA，将扩增样品送上海生工测序.登录Eztaxon网站(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)将测序结果通过序列比对鉴定.

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离及形态观察

根据实验方法1.5分离泡菜水中的乳酸菌，共获得10株变色明显的乳酸菌.在乳酸菌分离培养过程中，采用的是乳酸菌鉴别培养基，该培养基是在MRS固体培养基的基础上添加0.01%的溴甲酚绿，溴甲酚绿为酸碱指标剂，pH=5.4时呈蓝绿色，在pH=3.8时呈黄色，pH为4.5时开始有颜色变化.此次分离得到的10株乳酸菌在鉴别培养基中培养72 h后，菌落周围的蓝绿色基本褪去，呈黄色，表明菌落周围的pH=3.8左右，呈较强的酸性.将分离获得的菌在37℃恒温条件下培养48 h后，菌落在固体培养基中生长情况及形态、大小如表1所示.

由表1可知，LAB-1-1、LAB-1-2、LAB-1-5的生长速度最快，LAB-1-3、LAB-1-4、LAB-2-2的生长速度较好，LAB-2-3、LAB-2-5的生长速度最慢，所分离获得的10株乳酸菌均呈白色、小点状、光滑及湿润的菌落形态.

2.2 产酸特性测定

根据实验方法1.6将分离获得的10株乳酸菌接种到20 mL MRS液体培养基中，在37 ℃培养18 h,再接种到盛有150 mL液体MRS培养基的500 mL三角瓶中，每隔12 h测定其pH值，结果如表2所示.

由表2可知，在液体培养基中培养12 h后，10株乳酸菌的发酵液的pH值均降至4.5以下，24 h时，除LAB-1-1、LAB-1-5、LAB-2-1的pH大于4以外，其它乳酸菌均低于4，当发酵培养60 h时所有菌株的pH均达到3.8以下，表明分离获得的10株菌都具有良好的产酸特性，彼此之间的产酸能力差异较小.

2.3 降亚硝酸盐性能评价

根据实验方法1.7对10株菌的降亚硝酸盐能力进行检测，结果如表3所示.

从表3可知，10株乳酸菌均对亚硝酸钠具有降解能力，以LAB-1-5的降解能力最强，达到97.8%.蔬菜中含较高浓度的硝酸盐，尤其是一些根菜类、叶菜类蔬菜的硝酸盐含量高达1 500 mg/kg左右[11].硝酸盐在泡菜腌渍发酵过程中可以在一些微生物的作用下还原生成亚硝酸盐，后者可进一步可转化生成具有较强的致癌性的亚硝胺，对消费者的身体健康形成潜在的危害.在蔬菜腌渍过程中添加乳酸菌可以促进亚硝酸降解，降低产品中的亚硝酸盐含量.王英等[12]将具有优良降解亚硝酸盐性能的植物乳杆菌应用西兰花茎泡菜制作，发酵9 d时亚硝酸盐降至0.3 mg/kg以下.于沛等[13]从自然发酵泡菜中筛选得到高效降解亚硝酸盐的乳酸菌，在发酵萝卜生产中应用，产品的亚硝酸盐含量降至0.5 mg/kg以下.尹礼国等[14]从宜宾芽菜中筛选得到5株产酸能力强的乳酸菌、降亚硝酸盐能力均在90%以上，应用于低盐宜宾芽菜制作，可将产品的亚硝酸盐降至1.5 mg/kg左右.本研究获得的10株乳酸菌可进一步应用于泡菜生产，检测其在生产实践过程中降解泡菜中亚硝酸盐能力.

2.4 乳酸菌分子生物学鉴定

根据实验方法1.8对10株乳酸菌进行鉴定，结果如表4所示.

表4 乳酸菌分子鉴定Tab.4 Molecular Identification of Lactic Acid Bacteria

由表3可以得知，10株乳酸菌中9株菌为乳杆菌属(Lactobacillus)，1株为片球菌属(Pediococcus).根据Bosshard等[15]提出的16S rDNA序列相似率>99%定义为种，95%～99%可定义为属的标准，所有10株菌尚不能定义至种，需要进一步开展生理生化代谢特性研究.刘玉凌等[16]从重庆农户自制老盐水中分离到一株乳酸菌，经分子生物学鉴定为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，结合肠膜明串珠菌制备复合发酵剂应用于泡菜制作，可以提高产酸速度，明显降低亚硝酸盐峰值，提高食用安全性，感官品质也优于自然发酵的泡菜.为了进一步对分离得到的乳酸菌进行开发应用，需要对它们的生长特性与发酵特性开展研究.

乳酸菌是一类能将糖类化合物转化生成大量乳酸的细菌的总称，是一种习惯提法，具有物种多样性，广泛应用于食品工业、医药产业和农业生产.四川泡菜中的乳酸菌资源丰富，Nguyen等[17]从一种越南发酵蔬菜中分离到881株乳酸菌，其中56.6%为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，Xiong等[18]从泡菜水中分离到耐胆盐、胆酸的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum)，乌日娜等(2014年)[19]从东北酸菜中分离到24株乳酸菌，分别为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacilluscurvatus、Lactobacillusparacasei、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides).本研究根据企业生产实践需求，从四川泡菜中分离获得的10株乳酸菌分别为乳杆菌属和片球菌属，具有较好的产酸、降亚硝酸盐能力，可进一步开发为具有自主知识产权的生产用菌.在后期研究中，可采集更多的优质样品分离获得更多的菌种资源，保障泡菜产品品质与食品安全.

研究发酵食品中的微生物多样性除了经典的微生物培养方法外，现代分子生物学技术也是重要的手段.微生物培养技术只能获得环境中的部分微生物信息，为了全面了解四川泡菜的微生态信息，需要采用基于分子生物学技术的免培养技术开展研究.裴乐乐等[20]通过构建16S rRNA基因文库对4种盐渍菜细菌群落进行了分析，乳杆菌属与盐单孢菌属(Halomonas)是盐渍榨菜的优势属，乳杆菌属、盐厌氧菌属(Halanaerobium)和盐单孢菌属是盐渍萝卜的优势属，红杆菌科未分类细菌属(UnclassifiedRhodobacteraceae)、乳杆菌属等细菌属是盐渍豇豆的优势细菌属，红杆菌科未培养细菌属(UnclassifiedRhodobacteraceae)、盐单胞菌属、海洋杆菌属(Marinobacter)、需盐杆菌属(Salegentibacter)是盐渍青菜的优势细菌属.陈希等[21]采用建立16S rDNA克隆文库的方法对不同腌渍阶段的雪菜的细菌多样性进行了研究，结果表明，整个腌渍过程中微生物种类丰富，不同时期存在较大差异，腌制初期的优势菌群为肠杆菌属(Enterobacter)和欧文菌属(Erwinia)，发酵中后期以乳杆菌属的植物乳杆菌为主导.尹礼国等[2]采用PCR-DGGE对不同盐渍青菜样品的细菌群落结构进行了分析，乳杆菌属、魏斯氏菌属等细菌是主要细菌属.高通量测序技术是近年来开发的一种高效分子测序技术，在发酵食品微生态研究中得到了广泛应用.佟婷婷等[23]采用高通量测序技术对泡菜细菌群落结构研究表明乳杆菌属、魏斯氏菌属(Weissella)等细菌是主要细菌属.

3 结论

本研究从四川传统泡菜中分离得到10株菌，均具有良好的产酸与降亚硝酸盐性能，其中菌株LAB-1-5的降亚硝酸盐性能最高(97.8%).经过分子生物学鉴定，9株菌为乳杆菌属，1株菌为片球菌属.本研究以企业生产需求为导向，建立了优质乳酸菌分离筛选的方法，对促进企业科技转型具有重要意义.后期研究中，进一步加强优质样品采集，以分离获得更多的菌种资源，保障泡菜产品品质与食品安全.