新疆南疆地区4个地方绵羊品种微卫星标记的遗传多样性分析

赵冰茹，毋状元，董 红，霍 飞，陈 童，罗永明，王岳强，季 斐，郑新宝*

(1．中国农业大学 动物科学技术学院，北京 100083；2．新疆阿勒泰地区畜牧兽医站，新疆 阿勒泰 836501；3．新疆畜牧科学院畜牧研究所，新疆 乌鲁木齐 830011)

中国拥有丰富的绵羊遗传资源，其形成反映出不同生态环境下各民族畜牧业的文化发展历程，也为今后新品种的培育奠定了丰富的遗传基础[1]。新疆复杂的地形地貌及多样的生态与文化，构成了绵羊系统发育与演变的自然基础，成为中国绵羊遗传资源最丰富的省区[2]。多浪羊、巴尔楚克羊、柯尔克孜羊、巴音布鲁克羊均是新疆南疆地区优良的地方绵羊品种。从品种起源上看，多浪羊、巴音布鲁克羊是外来品种同本地羊杂交培育而成，而巴尔楚克羊、柯尔克孜羊是由当地绵羊培育而成。从地理位置上看，多浪羊、巴尔楚克羊的核心产区位于塔里木盆地西北部，而柯尔克孜羊、巴音布鲁克羊位于天山高寒地带[2]。

微卫星标记具有保守性，属于等显性遗传，多态性丰富，被认为是能广泛应用的遗传标记之一，对动物遗传多样性研究起到了巨大的推动作用[3-4]。本研究利用微卫星标记技术，开展了多浪羊、巴尔楚克羊、柯尔克孜羊、巴音布鲁克羊遗传多样性及遗传分化的研究，以期为新疆特有的地方绵羊品种保护、揭示其遗传结构、品种分类和科学开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验采集了分别来自新疆南疆地区麦盖提县种羊场、和静县巴音布鲁克羊种羊场、阿合奇县柯尔克孜羊保护区、巴楚县巴尔楚克羊种羊场的多浪羊、巴音布鲁克羊、柯尔克孜羊、巴尔楚克羊4个地方绵羊品种核心保种场或保护区的群体。由于公羊系谱档案清晰完整，每只公羊代表一个血统，因此，在保证样品个体具备品种的典型特征的基础上，选择无亲缘关系、系谱档案清晰的成年公羊。其中巴音布鲁克羊15只，柯尔克孜羊15只，巴尔楚克羊13只，多浪羊15只，共58只公羊。颈静脉采血3 mL，EDTA抗凝，血样运输过程中低温保存，后于-20 ℃冰箱冷冻保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用常规酚-氯仿抽提法提取血样中基因组DNA。利用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,USA)测定提取的DNA样品的完整性和浓度，将所有样品的浓度调整为50 ng/μL左右。

1.2.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、Marker、6×DNA Loading Dye由上海生工生物技术有限公司提供；高度去离子甲酰胺(HIDI)、分子量标记物LIZ500由美国ABI公司提供。

1.2.3 引物筛选 采用联合国粮食及农业组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的9个微卫星引物，荧光引物由上海生工生物技术有限公司合成，选择绿色(HEX)和蓝色(FAM)两种荧光标记，分子内标为LIZ500(美国ABI公司合成)，引物信息详情见表1。

表1 9个微卫星引物的信息Table 1 The information of 9 microsatellite loci

1.2.4 PCR扩增及产物检测 PCR反应体系：10 ×Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物(10 mmol/ L)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板(50 ng/μL)1 μL，用超纯水补充至25 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 变性30 s，55～60 ℃ 退火30 s(因位点而异)，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃ 延伸6 min。扩增产物4 ℃保存。

经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物合格后，由生工生物工程(上海)股份有限公司用DNA测序仪(AB 3730XL)进行毛细管电泳，用GENEMAPPER4.0软件(Applied biosystems)进行分子量标准校对和微卫星基因型分析。

1.3 统计分析

每个群体的观察等位基因数(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因数(Effective number of alleles，Ne)、Shannon信息指数(Shannon's Information index，I)、多态信息含量(polymorphic information content，PIC)、观察杂合度(observed heterozygosity，Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity，He)等遗传参数用PopGene32软件进行统计分析。F-statistics固定指数包括群体内近交系数(Fixation index of subpopulation，Fis)、总群体近交系数(Fixation index of total population，Fit)、群体间分化系数(Fixation index resulting from comparing subpopulations to the total population，Fst)和基因流(gene flow，Nm)，用FSTAT Version 2.9.3.2软件分析。用DISPAN软件包计算Nei's标准遗传距离(Nei's standard genetic distance , DS)和Nei's遗传一致度(Nei's genetic identity, I)；构建基于DS的UPGMA树。

2 结果与分析

2.1 微卫星座位多态性变化

PCR产物在DNA测序仪(AB 3730XL)测序后基因分型部分结果如图1所示。各峰图可清晰统计绵羊微卫星位点等位基因的片段长度。由于荧光毛细管电泳具有典型性峰形，便于统计判断等优点，保证了试验数据的可靠性。

2.2 不同绵羊品种的遗传多样性比较

表2结果表明，每个位点的Ne在不同群体中的分布是不均匀的，有比较明显的差异。9个微卫星位点的Na与Ne之间相差均较大，说明在这些基因座上，群体的等位基因分布不均匀，遗传差异较大，这可能是由于人工选择所造成的。而即使同一个微卫星座位，在不同的品种群体内，其等位基因频率和等位基因数目分布也是不均一的，如MAF70座位，柯尔克孜羊等位基因数目均多于其它3个品种，这充分体现了品种遗传上的差异。9个微卫星位点均为高度多态，这表明4个绵羊品种呈现丰富的遗传多样性。

表 2 4个绵羊品种9个微卫星标记的遗传多样性指数Table 2 Genetic diversity indexs in the 4 sheep breeds on the 9 microsatellite loci

2.3 群体杂合度和遗传分化分析

平均杂合度的大小可近似反映出群体遗传结构变异的高低，表3和表4结果表明：群体平均杂合度在0.7146～0.8573之间，座位的平均杂合度在0.7497～0.8600之间。各品种平均杂合度越大，反映了各品种变异程度也越大。对各微卫星标记进行F-统计，结果表明：FST的变化范围为0.0222～0.0545，平均值为0.0372；群体每代迁移数在4.3371～11.0227，平均值为6.4686。

表 3 4个绵羊品种观察杂合度和期望杂合度Table 3 The observed and expected heterozygosity in the 4 sheep breeds

表4 9个微卫星标记的F-统计量表，基因流，期望杂合度和观察杂合度Table 4 F-statistic analysis, gene flow, and the expected and observed heterozygosity on the 9 microsatellite loci

2.4 基于聚类分析的遗传关系

各品种间的Nei's标准遗传距离(DS)和Nei's遗传一致度(I)见表5，结果表明：柯尔克孜羊与巴音布鲁克羊群体的遗传距离最远(DS=0.2970)，其次是多浪羊和柯尔克孜羊群体(Ds=0.2763)，遗传距离最近的是多浪羊与巴尔楚克羊群体(Ds=0.1914)，巴尔楚克羊与巴音布鲁克羊群体(Ds=0.2079)遗传距离次之。这一结果与它们的地理分布基本一致。

4个绵羊品种基于DS的UPGMA树的聚类结果如图2所示，主要分为2个分支：多浪羊群体最先分离出来，单独聚为一类，为第一分支；剩下的3个群体聚为一类，为第二分支，巴音布鲁克羊再分离出来，巴尔楚克羊和柯尔克孜羊聚为一类。

表 5 4个绵羊品种的Nei's遗传一致度(I，对角线上)和Nei's标准遗传距离(DS，对角线下) Table 5 Nei's genetic identity (I, above the diagonal) and Nei's standard genetic distance(DS, below the diagonal) among 4 sheep breeds

3 讨 论

本研究对4个绵羊品种的9个微卫星位点进行分析，共检测到136个等位基因，平均有效等位基因数Ne在5.20～6.03之间，均大于5个，从而说明各品种内的遗传变异比较丰富。研究表明[5-6]，一个微卫星位点至少应有4个等位基因才能较为准确的应用于遗传多样性评估，因此，本研究所用的9个微卫星标记均可以用于绵羊遗传多样性的评估。在遗传连锁分析中，平均多态信息含量值大于0.7的微卫星位点为最理想的选择标记[7]，研究中选用的9个微卫星位点的PIC值平均为0.83，均为高度多态位点，因此，本试验选取的微卫星标记在4个绵羊群体中具有丰富的遗传多态性，可作为进一步连锁分析的侯选遗传标记，同时也说明这些地方品种间的个体差异性较大，遗传变异大，选择潜力大[8]。但由于本试验样本量较少，9种微卫星标记在这4个地方绵羊品种中还可能存在新的等位基因和基因型，有待扩大群体样本量深入分析。

遗传杂合度能反映群体在多个座位上的遗传变异，作为衡量群体遗传变异的最适参数之一[9]。本研究中群体平均杂合度在0.7146～0.8573之间，9个座位的平均杂合度为0.8058，属于高度杂合群体。度量群体间遗传差异程度的遗传分化系数(Fst)仅为0.0372，说明群体间的遗传变异为3.72%，而96.28%为群体内的遗传变异，表明4个绵羊品种具有相对较高的遗传多样性。基因流可以反映不同种群之间基因交流的过程，揭示种群间可能相互渗透的基因及影响遗传分化的遗传现象。研究表明，当Nm>1时，反映群体间的基因流水平较高，群体间遗传分化较小；当Nm>4时，则充分反映了种群间的基因交流，群体间遗传分化更小；当Nm<1时，说明群体可能由于遗传漂变而发生了分化[10-11]。本研究4个绵羊品种在9个微卫星标记的基因流平均值为6.4686，其中最大值达到了11.0227，最小值为4.3371，说明4个绵羊群体间存在较活跃的基因交流。

本研究计算了Nei's标准遗传距离，并根据标准遗传距离进行了UPGMA聚类。4个地方品种间的遗传距离以柯尔克孜羊与巴音布鲁克羊的距离最远，距离最近的是多浪羊与巴尔楚克羊。聚类结果表明多浪羊群体单独聚为一类，剩下的3个群体聚为一类，而巴尔楚克羊和柯尔克孜羊随后又聚为一类。李海等[12]利用血液蛋白多型性标记新疆南疆多浪羊、卡拉库尔羊和巴音布鲁克羊3种绵羊遗传结构，证实了它们相互间的遗传差异，聚类结果表明：多浪羊与巴音布鲁克羊的遗传距离较大，这与本试验结果相一致。杨燕等[13]利用26个微卫星标记分析了中国7个地方绵羊品种的种内遗传变异和品种间遗传关系，聚类结果表明哈萨克羊、阿勒泰羊和巴音布鲁克羊遗传关系很近，三者聚为一类。

巴音布鲁克羊的地理位置位于天山中部，以和静县巴音布鲁克草原为中心，是来源于蒙古羊同当地绵羊杂交，经长期风土驯化形成的地方优良品种[14]。巴尔楚克羊的地理位置位于新疆塔里木盆地西北缘，以巴楚县为中心，品种来源于当地绵羊经长期精心选育，逐步形成的地方优良品种[15]。柯尔克孜羊的地理位置位于天山南坡及塔里木盆地西缘，以克孜勒苏柯尔克孜自治州乌恰县为中心，品种来源于当地绵羊经长期精心选育，逐步形成的地方优良品种[16]。多浪羊的地理位置位于新疆塔里木盆地西部，以麦盖提县为中心，品种来源于中亚地区阿富汗购入的4只羊同当地绵羊杂交，经多年精心选育逐步形成的地方优良品种[17]。本研究中多浪羊与巴尔楚克羊遗传距离很近，这与二者都位于塔里木盆地西部绿洲，距离近且没有大的天然屏障有关，因此有较多的基因交流。而柯尔克孜羊与巴音布鲁克羊遗传距离较远，可能与二者位于天山山区不同区域有关。在本研究中多浪羊群体单独聚为一类，剩下的3个品种中巴音布鲁克羊再分离出来，最后巴尔楚克羊和柯尔克孜羊聚为一类，这可能是由于巴尔楚克羊和柯尔克孜羊均是南疆本地羊经长期精心选育，逐步适应了不同的生态环境，而巴音布鲁克羊、多浪羊是由外来品种同当地羊杂交后长期选育的结果。

4 结 论

本研究表明新疆南疆地区4个地方绵羊品种遗传多样性丰富，遗传杂合度较高，保持了群体的遗传稳定性，为进一步保护和利用当地绵羊品种提供了更为全面的遗传学依据，具有一定参考价值。同时，结合新疆绵羊品种资源现状，保种工作应有机结合开发利用，才可以保持可持续性发展。