利用荧光PCR-毛细管电泳法评价微卫星不稳定性检测国家参考品

张文新 黄传峰 孙楠 高飞 于婷 孙晶 曲守方 黄杰

微卫星（microsatellite，MS）是细胞基因组中以少数几个核苷酸（多为1～6个）为单位短串联重复的DNA 序列。微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是DNA复制时DNA错配修复（mismatch repair，MMR）功能缺陷，使微卫星重复序列的错误未得到纠正而引起微卫星序列长度发生变化的现象[1]。微卫星不稳定性可以分为3类：微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）、微卫星低度不稳定（microsatellite instability-low，MSI-L）及微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）[2]。微卫星不稳定与多种肿瘤的发生、发展密切相关，常见于胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌等肿瘤[3-5]。研究报道MSI-H型胃癌拥有独特的分子基因表型以及临床病理特征，比MSI-L 以及MSS型的预后好[6]。因此分析肿瘤组织的微卫星不稳定状态，可以指导肿瘤个体化治疗，具有重要临床意义。

目前临床上主要采用两种方法检测MSI和MMR，多重荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）毛细管电泳法直接检测MSI，或免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测MMR 蛋白的表达，主要包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 等MMR 蛋白[7-8]。随着检测技术发展，高通量测序（next generation sequencing，NGS）技术也应用于肿瘤组织的MSI检测[9]。目前国内已有公司申请MSI检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）的注册。亟需建立统一的国家参考品，用于评估MSI检测试剂盒的性能。本研究利用荧光PCR-毛细管电泳法检测微卫星不稳定性检测国家参考品，验证微卫星不稳定性检测国家参考品用于相关试剂盒性能评价及临床实验室质量评价的适用性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

微卫星不稳定性（MSI）检测国家参考品，批号：360028-201901，中国食品药品检定研究院提供。

1.2 试剂

微卫星不稳定性（MSI）检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法），上海普洛麦格生物产品有限公司提供。结直肠癌微卫星不稳定状态检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法），北京阅微基因技术有限公司提供。微卫星不稳定性（MSI）检测试剂盒（荧光PCR 毛细管电泳法），广州达瑞生物技术股份有限公司提供。对试剂盒厂家进行随机编号，分别为公司A，公司B，公司C。

1.3 仪器

3500 Dx基因分析仪和Veriti™Dx 96-well PCR仪，上海普洛麦格生物产品有限公司提供。3500xL Dx基因分析仪和Veriti™Dx 96-well PCR 仪，北京阅微基因技术有限公司提供。3500 Dx基因分析仪和ABI PCR 2720 仪，广州达瑞生物技术股份有限公司提供。

1.4 方法

各实验室按照据各自的方法以及试剂盒说明书进行操作。

1.4.1 PCR扩增

将PCR反应液、酶混合液、引物混合液、无核酸酶水置于室温解冻至完全溶解。配制除模板以外的反应体系，各组分加入后，涡旋振荡后，分装到0.2 mL PCR 管中。依次向已分装扩增体系的各管中加入1 μL 或者0.5 μL 待检样本、MSI 阳性对照、阴性对照（无核酸酶水）。将各反应管放置于PCR 仪的反应槽内，运行PCR 程序。

1.4.2 基因分析仪检测扩增片段

PCR反应结束之后，制备毛细管电泳检测样品。以基因分析仪进行毛细管电泳检测。使用POP7 胶。选择“Fragment”电泳方法，参考基因分析仪的使用说明书。检测数据使用GeneMapper®分析软件进行数据分析。

1.4.3 结果判定

统计试剂盒微卫星检测位点，对样本的微卫星不稳定性状态进行判定：≥2个微卫星位点不稳定，判断为MSI-H；1个微卫星位点不稳定，判断为MSI-L；没有微卫星位点不稳定，则判断为MSS。

2 结果

2.1 阳性参考品结果

对国家参考品中的16 对阳性参考品共32例样本进行检测，3家试剂盒的结果显示均为微卫星高度不稳定。以国家阳性参考品MSI-3及其对应的配对参考品MSI-3-对照的检测结果为例，A公司选择的8个位点均为微卫星不稳定位点，B公司选择的6个位点均为微卫星不稳定位点，C公司选择的6个位点也均为微卫星不稳定位点，均检出相应的微卫星不稳定性状态。见图1。

2.2 阴性参考品结果

对国家参考品中的3 对阴性参考品共6例样本进行检测，3家试剂盒的结果显示均为微卫星稳定（MSS）。以国家阴性参考品MSI-19及其对应的配对参考品MSI-19-对照的检测结果为例，A公司选择的8个位点中都没有微卫星不稳定位点，B公司选择的6个位点中都没有微卫星不稳定位点，C公司选择的6个位点中也都没有微卫星不稳定位点，均检出相应的微卫星不稳定性状态。见图2。

2.3 检测限参考品结果

对国家参考品中的6 组检测限参考品共24例样本进行检测，3家试剂盒的结果显示，对20%和10%肿瘤DNA 含量的检测限参考品均能正确检出相应的微卫星不稳定性状态，而有1家试剂盒对5%肿瘤DNA 含量的检测限参考品未能正确检出相应的微卫星不稳定性状态。

以国家检测限参考品MSI-LOD3-20%、MSILOD3-10%、MSI-LOD3-5%及其对应的配对参考品MSI-LOD3-对照的检测结果为例，A公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的8个位点都为微卫星不稳定位点，B公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的6个位点中分别有6个和3个微卫星不稳定位点，C公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的6个位点中分别有6个和5个微卫星不稳定位点，都检出相应的微卫星不稳定性状态。同时A公司MSI-LOD3-5%的8个位点中有7个微卫星不稳定位点，C公司MSI-LOD3-5%的6个位点中有3个微卫星不稳定位点；但B公司MSI-LOD3-5%的6个位点中仅有1个位点为微卫星不稳定位点，未检出相应的微卫星不稳定性状态。见图3。

3 讨论

MSI是一种遗传性改变，与肿瘤的发生密切相关。MSI检测已被美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）结直肠癌临床实践指南及中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结直肠癌患者[10-11]。2016年，欧洲临床肿瘤协会（European Society for Medical Oncology，ESMO）转移性结直肠癌共识提出，MSI检测对转移性结直肠癌患者免疫检查点抑制剂治疗具有重要的预测价值。2017年美国食品药品管理局（FDA）批准了默沙东公司的帕博利珠单抗注射液（Keytruda），用于治疗携带MMR功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）和微卫星高度不稳定性（MSI-H）的晚期（转移性）实体瘤患者。MSI 作为晚期（转移性）实体瘤特别是结直肠癌患者免疫治疗疗效的预测生物标志物，其检测具有重要的临床意义。

MSI检测的常用方法是多重荧光PCR 毛细管电泳法，它的原理是选择美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）推荐的微卫星（MS）位点[12-13]，进行PCR扩增及毛细管电泳，比较肿瘤组织与正常对照组织的结果，确定MSI 状态。为了标准化MSI 的检测，1998年NCI 推荐Bethesda 指南，推荐2个单核苷酸重复位点BAT-25和BAT-26和3个双核苷酸重复位点D2S123、D5S346和D17S250。2002年NCI 进行修订，推荐5个单核苷酸重复位点BAT-25、BAT-26、NR21、NR24和NR27。Bacher 等人提出Promega分析系统，以Mono-27 取代NR27，并增加Penta C和Penta D 用于识别样本，进一步提高了MSI检测的敏感性。我国CSCO 结直肠癌诊疗指南（2018年版）建议采用NCI推荐的BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346和D17S250 位点进行MSI检测。

目前国家药品监督管理局尚未批准微卫星不稳定性检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）。至今MSI检测技术仍没有较为统一的标准，肿瘤MSI检测位点不仅仅包括以上推荐位点。为了提高MSI检测的敏感性和特异性，不同厂家的试剂盒开发并选择了不同的检测位点。为了更好评价上市前的微卫星不稳定性检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）性能，建立标准化的统一的国家参考品是非常有必要的。本院建立的微卫星不稳定性检测国家参考品，来源于FFPE 肿瘤组织或者细胞系以及相应的配对样本，包括了微卫星高度不稳定、微卫星低度不稳定及微卫星稳定三种状态，其中微卫星高度不稳定参考品涵盖了不同的微卫星不稳定位点，能够有效的评价试剂盒的性能。为了评价试剂盒的检测敏感性，还根据目前临床实际应用的检测水平，设置不同肿瘤DNA 含量的样本，包括20%、10%、5%三种梯度。

3家不同公司的微卫星不稳定性检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）对国家参考品62例样本的结果显示，阳性参考品的结果均为微卫星高度不稳定，阴性参考品的结果均为微卫星稳定，20%和10%肿瘤DNA 含量检测限参考品的结果均符合国家参考品的标示结果，而有1家试剂盒对5%肿瘤DNA 含量的检测限参考品未检出相应的MSI 状态。国家阳性参考品和阴性参考品的检测结果表明虽然3家公司所选择的微卫星不稳定性位点有所差异，但是对同一份样本的微卫星不稳定状态的结果判定是一致的，均检出相应的微卫星不稳定性状态，结果准确。从国家检测限参考品的检测结果，发现有的试剂盒对于5%肿瘤DNA 含量的检测限参考品不能检测出相应的微卫星不稳定性状态。在临床实际检测中MSI检测限一般规定为20%。如果提高试剂盒检测的敏感性，可能会降低检测的特异性。根据临床实际应用，微卫星不稳定性（MSI）检测国家参考品要求试剂盒对20%和10%肿瘤DNA 含量的检测限参考品应检出相应的微卫星不稳定性状态；对5%肿瘤DNA 含量的检测限参考品可检出或未检出相应的微卫星不稳定性状态。3家公司的微卫星不稳定性检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）的检测结果显示均符合国家参考品的阳性参考品符合率、阴性参考品符合率和检测限的要求。本实验室建立的国家参考品，可满足微卫星不稳定性检测的要求，适用于荧光PCR-毛细管电泳法试剂盒的性能评价及临床实验室的质量评价。