原花青素B2通过抑制NLRP3活性减轻过氧化氢对H9c2细胞的损伤

姚鹏梅，刘倩倩，金 婷，唐富天，刘 义

(锦州医科大学 1. 附属第一医院内科，2. 基础医学院药理学教研室，辽宁，锦州 121001；3. 兰州大学第二医院心血管研究所，甘肃，兰州 730030)

原花青素属于多酚类黄烷醇，由儿茶素和(或)表儿茶素组成的单聚物或多聚合物[8-9]。B型原花青素(procyanidins type B，PCB)主要存在于水果和蔬菜中[10]，食用富含PCB的饮食可降低肥胖、2型糖尿病和心血管疾病的风险[11]。炎症反应是上述疾病的重要病理特征[12]，PCB对心血管疾病的保护作用与其抗炎活性密切相关。有研究发现，原花青素B2(procyanidins type B2, PCB2)对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的血管内皮细胞损伤有明显的保护作用[11]，该作用与抑制NLRP3炎性小体活化和氧化应激有关。本研究旨在研究PCB2对H2O2诱导的心肌细胞损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 H9c2心肌细胞系，购自中科院细胞库。

1.1.2试剂 PCB2(批号：365358)和H2O2(批号：323381)购自Sigma-Aldrich公司。NLRP3(批号：ab263899)、caspase-1(批号：ab238979)、IL-1β(批号：ab9722)和IL-18(批号：ab71495)以及GAPDH(批号：ab8245)抗体购自Abcam公司。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH，批号：A020-2-2)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA，批号：A003-1-2)含量、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC，批号：A015-1-2)、SOD(批号：A001-3-2)、CAT(批号：A007-1-1)和GSH-Px(批号：A005-1-2)活性测定试剂盒购自南京建成生物技术公司。二氢乙啶(dihydroethidium，DHE，批号：D1168)荧光染料购自上海浩然生物技术有限公司。

1.2仪器 细胞培养箱(美国Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1细胞分组 将H9c2细胞分为5组：对照组(Control)、H2O2组、H2O2+PCB2(5 mg·kg-1)组、H2O2+PCB2(15 mg·kg-1)组和H2O2+PCB2(45 mg·kg-1)组。

1.3.2细胞活力测定 用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]还原法检测细胞活力。将细胞接种于96孔板中，密度为50 000个细胞/孔。在每个孔中加入100 μL MTT(2 g·L-1PBS)，37 ℃孵育4 h，加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)后在550 nm波长下测量吸光度。结果以细胞存活率百分比表示，对照细胞为100%。

1.3.3细胞毒性测定 使用试剂盒测定培养基中LDH的活性。

1.3.4MDA测定 以硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)反应产物表示MDA。

1.3.5细胞内ROS测定 用DHE评价细胞内活性氧生成。用稀释后的0.01 mol·L-1DHE在PBS中37 ℃孵育30 min，然后用PBS洗涤细胞2次。在激发波长为485 nm和发射波长为530 nm下，测量荧光强度。

1.3.6SOD活性测定 采用Marklund和Marklund(1974)描述的方法测量SOD活性。反应混合物含有Tris-DTPA(pH 8.2)、0.15 mmol·L-1邻苯三酚和10 mmol·L-1HCl。用分光光度计在420 nm波长下测定吸光度。

1.3.7CAT活性测定 过氧化氢酶活性测定采用Aebi(1984)所述的方法。将总提取物样品加到50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。用分光光度计在240 nm波长下测定吸光度。

1.3.8谷胱甘肽过氧化物酶活性 GSH-Px活性测定采用Paglia和Valentine法(1967)。将提取物样品与50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、4 mmol·L-1叠氮化钠、1 mmol·L-1EDTA、4 mmol·L-1GSH、27 U谷胱甘肽还原酶和0.2 mmol·L-1NADPH孵育4 min。用分光光度计在340 nm波长下测定吸光度。

1.3.9蛋白质提取和蛋白质印迹 用含有50 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1EDTA、100 mmol·L-1NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液提取细胞蛋白。用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。样品在SDS-PAGE上分离并转移到PVC膜上。用抗NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的抗体在TBS-T缓冲液中于48 ℃孵育过夜，然后用HRP结合的抗体孵育1 h。

2 结果

2.1 PCB2对H2O2所致H9c2细胞损伤的影响与Control组相比，H2O2处理的H9c2细胞活力降低(Fig A)，而培养基中的LDH活性增加(Fig B)。而与H2O2组相比，PCB2剂量依赖性地提高细胞活力，降低LDH活性，表明PCB2对H9c2所致的细胞损伤有保护作用。

2.2 PCB2对H2O2所致H9c2细胞中炎性小体蛋白表达的影响与Control组相比，用H2O2处理的H9c2细胞中NLRP3，caspase-1，IL-1β和IL-18(Fig 2A，2B)蛋白表达增加。与H2O2组相比，PCB2能够下调细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达，且该作用有剂量依赖性。

2.3 PCB2对H2O2所致H9c2细胞中ROS和MDA含量的影响与Control组相比，用H2O2处理的H9c2细胞中ROS(Fig 3A, 3B)和MDA的产生增加(Fig 3C)。与H2O2组相比，PCB2能够降低细胞中ROS和MDA含量，且该作用有剂量依赖性。

2.4 PCB2对H2O2所致H9c2细胞中抗氧化酶活性的影响结果显示，与Control组相比，H2O2处理的细胞中T-AOC(Fig 4A)、SOD(Fig 4B)、CAT(Fig 4C)和GSH-PX(Fig 4D)的活性均降低。 而与H2O2组相比，PCB2能够剂量依赖性地增加H9c2中T-AOC、SOD、CAT和GSH-PX的活性。

Fig 4 Effect of PCB2 on activities of T-AOC, SOD, CAT and GSH-PX in H9c2 cells treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

Fig 3 Effect of PCB2 on ROS and MDA content in H9c2 cells treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

Fig 1 Effect of PCB2 on cell viability and medium LDH activity of H9c2 treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

Fig 2 Effect of PCB2 on protein expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β and IL-18 in H9c2 cells treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

3 讨论

本研究结果显示，PCB2能够减轻H2O2引起的H9c2细胞损伤，降低细胞NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达，降低细胞MDA含量和ROS产生，增加T-AOC、SOD、CAT和GSH-Px活性。结果表明，PCB2通过抑制氧化应激和NLRP3炎性小体激活来保护H9c2细胞免受H2O2引起的损伤。这一发现揭示了PCB2保护心肌细胞损伤的新机制。

炎症小体在调节炎症反应和心脏病方面起重要作用[13]。NLRP3炎性小体是一种包含胞内受体(主要是NOD样受体)、半胱天冬氨酸(caspase-1)前体和ASC蛋白的蛋白质复合体[14]。本研究表明，与对照组细胞相比，H2O2处理的细胞NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达增加。而PCB2剂量依赖性地降低这些蛋白的表达。这些结果表明，PCB2能够降低H9c2细胞中NLRP3炎性小体的活化。这些结果可以解释为什么PCB2保护H9c2细胞免受H2O2造成的损害。与上述研究结果一致的是，有文献报道，葡萄籽来源的原花青素通过抑制NLRP3炎性体而减轻痛风症状[15]，PCB2通过抑制LPS诱导的人血管内皮细胞中NLRP3炎性体激活而保护细胞免受氧化损伤[8]。然而，PCB2抑制炎性小体的作用机制还不十分清楚。

有研究报道， H2O2通过增加ROS引起人血管内皮细胞炎症小体的活化，因为DPI(ROS清除剂)能够降低NLRP3炎性体激活，并且PCB2可以减少内皮细胞中ROS的积累[7-8]。这一发现与ROS在其他类型细胞炎症小体激活信号中的作用一致[7, 16]。ROS是细胞内氧化还原反应的正常代谢产物，而过量的ROS会引发促炎过程。PCB2具有很强的抗氧化性能，主要由于芳环含有丰富的羟基。另一方面，本研究和其他研究表明，PCB2还能够增加抗氧化酶(包括SOD，CAT，GSH-GPx)活性[15, 17]。据报道，PCB2具有潜在的抗氧化活性，可用于预防、治疗糖尿病和动脉粥样硬化等炎症性疾病[8, 10, 11]。

总之，该研究表明PCB2通过抑制氧化应激和NLRP3炎性体激活来减弱H2O2引起的H9c2细胞损伤。