基于综合生物信息学筛选山茱萸-牡丹皮抗肝损伤潜在活性成分及靶点

白颖锋，李雪梅，韩 笑，刘 佳，陆兔林，毛春芹，杭爱武

(南京中医药大学1.中医学院中药学教研室、2.药学院中药炮制学教研室，江苏 南京 210023)

肝损伤是临床肝系疾病常有的一种病理状态。长期肝损伤会导致疾病向肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的方向转化。抗肝损伤成为临床治疗肝病的重要环节，近年来肝损伤也成为了肝病研究的一大热点问题。

山茱萸、牡丹皮配伍出自于张仲景《金匮要略》的肾气丸，宋代钱乙的《小儿药证直诀》将肾气丸加减化裁为六味地黄丸。此后六味地黄丸的临床应用范围不断扩展，至清代高秉钧在《疡科心得集》中说明六味地黄丸可以治“肝肾不足”等证。现代临床用药规律研究发现，治疗肝硬化的二对药常见配伍中包含山茱萸和牡丹皮[1]。药理研究也将六味地黄丸拆成3个“一补一泻”配伍[2]，即山茱萸与丹皮，熟地与泽泻，山药与茯苓。现代临床运用和实验研究拓展了中药的应用范围。

中药中含有复杂的成分，是天然的化合物宝库，中药成分、组分配伍成为名优中药二次开发的重要途径。通过中药数据库和生物信息学方法，可以预测中药治疗疾病的有效成分与潜在靶点，并筛选有效的中药配伍。为分析山茱萸、牡丹皮两药及配伍后抗肝损伤的潜在活性成分和靶点，试从如下方面进行探讨。

1 方法

1.1 山茱萸、牡丹皮化学成分筛选与靶点预测

1.1.1潜在活性成分的获得与筛选 中药系统药理学数据库(traditional chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)中分别收集山茱萸和牡丹皮的化学成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 0.30、类药性(drug-likeness，DL)≥ 0.18为标准筛选潜在活性成分。

1.1.2潜在活性成分的靶点预测 PubChem中收集潜在活性成分的SMILE结构式，并下载SDF格式的结构文件。利用SwissTargetPrediction数据库、Drugbank数据库和相似系综(similarity ensemble approach，SEA)数据库进行成分的靶点预测，均选择人类数据库(homo sapiens)。标准见Tab 1。

Tab 1 Target prediction criteria for potential active ingredients

1.2 山茱萸、牡丹皮抗肝损伤靶点的获得在治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)、遗传关联数据库(genetic association database，GAD)和DisGeNET数据库的搜索功能中检索 “Liver disease” “Liver injury” “Liver” “Hepatic”等关键词，筛选出疾病相关靶点。将潜在活性成分的预测靶点与疾病靶点比对并取交集，获得山茱萸、牡丹皮抗肝损伤的靶点数据集。通过Uniprot获得各靶点Uniprot ID备用。

1.3 GO富集分析与KEGG通路富集分析利用注释、可视化和综合发现数据库(the database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID)的Functional Annotation功能，进行基因本体(gene ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析。物种选择人类(homo sapiens)。

1.4 “中药-化合物-靶点-通路-疾病”网络的构建将数据导入Cytoscape3.2.1软件中，构建“中药-化合物-靶点-通路-疾病”网络。

1.5 应用受试者工作特性曲线评价核心靶点将中药抗肝损伤的靶点导入String数据库，构建蛋白-蛋白相互作用网络，计算自由度，并挑选出网络中的核心靶点。利用基因表达综合数据库(gene expression omnibus，GEO)中的相关数据集，构建疾病-对照的模型验证集，用受试者工作特性(receiver operator characteristic，ROC)曲线评价核心靶点与非酒精性脂肪肝炎过程肝损伤的关联程度。

2 结果

2.1 山茱萸、牡丹皮的潜在活性成分与潜在靶点经筛选得到山茱萸活性成分20个，牡丹皮活性成分11个(Tab 2、3)。经数据库靶点分析得到，山茱萸潜在靶点共776个，牡丹皮潜在靶点共625个。

2.2 山茱萸、牡丹皮抗肝损伤靶点的筛选疾病数据库筛选出疾病靶点共有677个(已排除重复信息)。中药预测靶点数据与疾病靶点取交集后，得到山茱萸、牡丹皮活性成分作用的靶点分别为52个和69个。筛去重复信息，得到山茱萸、牡丹皮抗肝损伤靶点共78个，其中共同靶点43个(Tab 4)。

Tab 4 Information of targets

Tab 3 Information of active ingredients in Cortex moutan

Tab 2 Information of active ingredients in Fructus corni

2.3 GO富集分析与KEGG通路富集分析GO富集分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞组分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3个部分，3者均设置P<0.05。GO-BP分析共有194个结果，包含类固醇代谢、外源性物质代谢、类固醇激素介导的信号通路、对脂多糖的反应、血管生成等途径；GO-CC分析有24个结果，影响到细胞器膜、细胞外空间、膜孔、质膜、细胞表面等细胞组分；GO-MF分析有62个结果，对于RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、类固醇激素受体活性、酶结合、氧结合、血红素结合等分子功能。

将山茱萸、牡丹皮抗肝损伤的靶点数据集进行KEGG通路分析，设定P<0.05，得到68条通路结果，剔除与肝损伤无关的特定疾病通路后结果为32条。富集的通路主要为低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factors1，HIF-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、破骨细胞分化(osteoclast differentiation)、胆汁分泌(bile secretion)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、细胞色素P450代谢外源性物质(cytochrome P450)、小分子G蛋白Ras、脂肪细胞因子(adipocytokine)、小分子G蛋白Rap1、丙型肝炎等信号途径。按P值升序排列，使用R语言将GO分析各部分和KEGG分析排名前10的结果分别绘制成如下图(Fig 1、2)。

2.4 “中药-化合物-靶点-通路-疾病”网络图的绘制将32条通路相关的靶点、化合物数据整理出来，并采用Cytoscape3.2.1软件绘制“中药-化合物-靶点-通路-疾病”网络图(Fig 3)。其中共有108个节点，447条边。节点有中药2味，化合物27个，靶点46个，通路32条，疾病1个。根据自由度从高到低排列，槲皮素(quercetin，19)、山奈酚(kaempferol，14)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，12)、谷甾醇(sitosterol，12)、豆甾醇(stigmasterol，12)等可能是发挥药效的主要成分；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1，26)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基γ(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma，PIK3CG，25)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1，PTPN1，19)、丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8，17)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA，16)、ATP结合盒亚家族B成员1(ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1，16)、肿瘤坏死因子(TNF，16)、Jun原癌基因(Jun proto-oncogene，JUN，13)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR，12)、细胞色素P450家族2亚家族C成员19(cytochrome P450 family 2 subfamily C member 19，CYP2C19，11)等可能是山茱萸、牡丹皮抗肝损伤的重要靶点。

Fig 1 Results of GO enrichment analysis(TOP10)

Fig 2 Result of KEGG enrichment analysis(TOP10)

2.5 ROC曲线评价结果将靶点导入String数据库后，按综合得分≥0.90为标准筛选数据，绘制网络见Fig 4，包含59个节点，121条边。GEO数据库中筛选得到GSE63067数据集，其中有非酒精性脂肪肝炎临床样本9例，健康样本7例，对数据集进行探针去重、数据标准化、分组验证(Fig 5)，利用“Limma”包进行差异分析后，将蛋白网络中自由度前9的靶点输入验证集进行验证，并绘制ROC曲线(Fig 6)，图中括号表示ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)在0.95下的置信区间。AUC在0～0.50、>0.50～0.70、>0.70～0.90和>0.90～1分别表示关联程度的四个等级。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、MAPK8和CYP2C19的AUC分数均处于>0.70～0.90之间。与健康对照组比较，疾病组的VEGFA、ESR1、MAPK8的表达具有明显差异(P<0.05)，CYP2C19的表达不明显。

Fig 6 Results of ROC

Fig 5 Heatmap(Top 200)

Fig 4 Protein-protein interaction network

Fig 3 “Chinese medicine-compound-target-pathway-disease”network of Fructus corni and Cortex moutan for treating liver injury

3 讨论

3.1 山茱萸、牡丹皮抗肝损伤潜在活性成分研究结果显示，山茱萸、牡丹皮中筛选出的成分以黄酮和甾醇类为多，如槲皮素、山奈酚等黄酮类成分，β-谷甾醇、豆甾醇等甾醇类；另外有没食子酸衍生物等鞣质，芍药苷、丹皮苷等苷类成分，四氢苦参碱等生物碱，以及一些有机酸。

中药包含的成分种类丰富，在中药抗肝损伤网络中可能发挥协同作用。核心成分槲皮素对脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的肝损伤具有保护作用，可明显减少TNF-α等炎症细胞因子，通过抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)和MAPK信号通路的活化起到抗凋亡和抗炎作用[3]。山奈酚可下调细胞色素CYP2E1表达，恢复抗氧化酶活性达到保肝作用，也可以明显减弱非甾体抗炎药乙酰氨基酚诱导的血清TNF-α和白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)的产生，下调c-Jun氨基末端激酶和细胞外信号调节激酶的磷酸化，减少肝细胞凋亡[4]。β-谷甾醇和它的衍生物可明显降低炎症因子TNF-α等的水平，抑制Toll受体4(Toll like receptor 4，TLR4)和NF-κB介导的氧化和炎症反应改善脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤[5]。课题组前期研究表明，山茱萸环烯醚萜总苷可以增强细胞的抗氧化能力，降低凋亡蛋白表达，发挥保肝作用[6]。

3.2 山茱萸、牡丹皮配伍抗肝损伤的潜在靶点KEGG富集分析结果中包含的成分有27个，成分通过46个靶点映射到疾病相关的32条通路上，共含有447条边，体现了成分、靶点与通路3者关联密集，构成了完整又系统的网络，说明中药治疗疾病的整体性与系统性，也在一定程度上体现了中医理论中“异病同治，同病异治”的观点。

在网络图中由自由度排列筛选出来的10个基因是山茱萸、牡丹皮配伍抗肝损伤的潜在靶点。AKT1在PI3K/AKT1信号途径中占核心地位，是细胞存活的信号介质。在通路中，一类PI3K可以激活下游信号通路，参与细胞活化、增殖和分化，PI3K抑制剂可在肝纤维化过程中抑制肝星状细胞的活化，缓解肝损伤[7]。PTPN1是一种胞内酶，又称PTP1B，胆汁淤积期间，肝细胞中的胆汁酸激活炎症通路，慢性轻度炎症会诱导PTPN1的表达，而PTPN1的缺失可以保护胆汁酸诱导的细胞凋亡[8]。当肝脏暴露于毒性物质或部分切除时会迅速开始再生的过程，PPARA可能是通过影响脂质代谢和直接调节细胞周期相关基因影响肝再生[9]，EGFR信号轴已被证明在急性和慢性肝损伤后的肝再生过程中起关键作用[10]。药物在治疗疾病过程中其代谢产物也有可能对肝细胞结构和功能有损伤。临床报道阿托伐他汀由CYP3A4、CYP2C19等代谢，随后其代谢产物被ABCB1介导从肝脏到胆汁转运消除，ABCB1的基因多态性与阿托伐他汀导致的肝损伤有关[11]，可从基因出发研究药物性肝损伤的缓解机制。

3.3 非酒精性脂肪肝过程中的肝脏损伤非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一系列病理过程的总括，包括肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)等。肝损伤是NAFLD过程中持续性的病理反应。肝脏代谢脂肪酸的能力降低导致有毒脂质的堆积，从而诱导肝细胞应激、损伤和死亡。

GEO数据库基于基因芯片技术，构建疾病验证集之后，应用ROC曲线评价核心靶点与非酒精性脂肪肝炎过程中肝损伤的关联程度，在非酒精性脂肪肝炎病理过程中肝脏损伤程度较高。VEGFA是诱导血管生成的关键因子。在非酒精性脂肪肝从普通脂肪变性转为NASH的过程中，脂肪过度堆积，诱导细胞炎症，招募单核细胞、巨噬细胞和血小板聚集，通过不同途径来启动血管生成。与健康对照组相比，普通脂肪变性和NASH患者血清TNF-α和IL-6水平升高，可溶性VEGF受体1(sVEGFR1)水平明显升高，说明血管生成细胞因子参与了非酒精性脂肪肝的病理转变过程[12]。ESR1被报道与脂质代谢有关，其过度表达可能与肝脏脂肪堆积有关，这是非酒精性脂肪肝发展的第一步，并可能演变成为NASH、肝硬化及肝癌，在肥胖相关的肝脏脂肪变性的发病机制中，ESR1启动子甲基化图谱似乎发挥了表观遗传标记的作用[13]。

生物信息学通过差异基因分析，筛选临床疾病样本与健康样本中差异表达明显的靶点，结合网络药理学筛选的中药治疗疾病靶点，可以将研究重点聚焦到少数基因；其局限性是研究样本来自临床，使验证难度增加。

通过多种数据库和平台构建的中药山茱萸、牡丹皮抗肝损伤作用网络包含多成分、多靶点、多途径，其中抗肝损伤核心成分以黄酮类和甾醇类为主，如槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等，部分潜在活性成分可能成为保肝药物的候选成分，也为中药成分、组分配伍提供参考。筛选得到的网络中核心靶点如AKT1、PIK3CG、PTPN1、MAPK8、PPARA等，可作为研究山茱萸、牡丹皮抗肝损伤可能机制的着手点，但仍需进一步实验验证。在ROC曲线评价中，VEGFA、ESR1和MAPK8与非酒精性脂肪肝炎过程中肝损伤的关联程度较高。综合生物信息学可以分析疾病的潜在靶点，也为中药治疗疾病潜在机制的研究提供思路。