牛初乳小分子多肽的分离及其抗菌作用的研究

郭瑞峰 ，李雪梅 ，刘少伟 ，姚刚

( 1.华东理工大学生物工程学院国家重点实验室，上海200237；2．中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所食品安全研究中心，上海200031；3.上海健康医学院医学技术学院上海201318)

0 引 言

牛初乳是健康母牛分娩后7 天内特别是3 天内分泌的淡黄色乳汁，黏稠度大，且有特殊的苦味[1]。因富含优质蛋白、脂肪、维生素和矿物质，营养价值往往高出常乳几倍到几十倍；并且含有大量免疫因子、生长因子等活性功能成分，因此能增加机体免疫力从而更加有效的抵抗病菌感染，并增强机体抵抗外界环境应激的能力[2]。牛初乳中的免疫因子主要包括乳铁蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶以及免疫球蛋白，这些因子也称为抗菌因子[3-4]，因此在抗生素没有问世前，很多国家或是地区都把牛初乳作为抗病食物食用。19 世纪50 年代，牛初乳制品(免疫乳)曾被用于治疗疾病，20 世纪70 年代，大量的喂养实验证明牛初乳的优质抗病地位，1990 年前后科学家开始从功能性食品角度关注牛初乳的开发问题，整理出大量有关研究报告，确认了其作为卓越天然抗病食物的地位，并指出牛初乳可直接用于制造免疫及其他功能性的食品[5-7]。此外，牛初乳还含有大量的糖复合物，从而影响免疫系统的功能[8-9]。然而，目前对于牛初乳的研究仅限于其中的大分子生物活性物质，对于其中小分子物质成分却鲜有涉及。

葡聚糖凝胶色谱法可以根据样品相对分子质量的大小来分离蛋白质及多肽分子，反相高效液相色谱法则可将相对分子量比较接近但是极性不同的蛋白加以分离。本实验经切向流超滤初步分离得到牛初乳3 ku 以下的蛋白多肽，并通过葡聚糖凝胶色谱法联合反相高效液相色谱法进一步分离纯化，随后将分离得到的组分进行抑菌实验并做多肽/蛋白质N 端测序分析，确定了牛初乳中3 ku 以下成分的N 端氨基酸序列，为牛初乳的研究和利用开发提供了一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

牛初乳由上海奶牛场提供；大肠杆菌为本实验室保存；无水乙醇、甲醇，上海国药集团；OXOID 牛肉膏；OXOID 胰蛋白胨；Sephadex G-10，G-15，G-25及G-50交联葡聚糖凝胶；SY-MU2010切向流超滤系统；ODS-C18 反相高效液相色谱，YMC 公司；HD-4核酸蛋白检测仪，上海青浦沪西仪器厂；Thermo 冷冻干燥机；ZD-85 气浴恒温振荡器，常州金坛良友仪器有限公司；Thermo 酶标仪；超净工作台，苏州净化；Thermo低温离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 牛初乳的预处理

牛初乳通过低温离心脱脂去除上层脂肪，之后利用 2 mol/L HCL 调节 pH 值至 4.0～5.5，搅拌混匀于45 ℃水浴30 min 后再经 8 000 g、4 ℃离心 10 min，去除酪蛋白沉淀，在上清蛋白溶液中根据牛初乳的体积加入20%的酒精以沉淀白蛋白，再于4 ℃以8 000 g离心20 min，弃去下层的蛋白沉淀后，取出上层清液；之后再利用SY-MU2010 切向流超滤系统对所得溶液进行超滤，在0.06 Pa 压力下使其依次通过10 ku 和3 ku 超滤膜，从而得到 10 ku 以上、3～10 ku 区间以及3 ku以下区段的蛋白。

1.2.2 3 ku以下小分子蛋白片段的抑菌试验

把收集的不同区段的蛋白溶液及去除的酪蛋白分别放入茄型瓶中，冻干后收集，称重，记录获得的质量数据。采用牛初乳中3 ku 以下小分子蛋白片段组份进行抑菌试验。

收集到的牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段经过冷冻干燥后用液体LB 培养基配制成100 mg/mL 的溶液，再过滤除菌备用。在无杂菌条件下取200 μL 大肠杆菌菌液于10 mL 液态LB 培养基中，置于37 ℃摇床培养过夜，第二天早上将活化好的菌液取100 μL 加至10 mL 液态LB 培养基中，震荡混匀后加入到96 孔板中，每孔滴加100 μL，获得96 孔板菌悬液。实验组及对照组设置如下：50 mg/mL 组，在菌悬液孔中分别滴加牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段溶液100 μL；25 mg/mL 组，在菌悬液孔中分别滴加牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段溶液50 μL 并添加液态LB 培养基50 μL；阴性对照组，在菌悬液孔中分别滴加液态LB培养基100 μL；阳性对照组，在菌悬液孔中分别滴加含30 μg/mL 卡那霉素的液态LB 培养基 100 μL；空白对照组，在不加菌悬液的空孔中分别滴加不含大肠杆菌的LB 培养基200 μL，所有分组均设置复孔并置于37 ℃培养箱中以70 rpm/min 转速震荡培养，每隔1 h在酶标仪上用600 nm 的波长检测一次。

1.2.3 葡聚糖凝胶色谱分离

将预处理好的葡聚糖凝胶填装于色谱柱，去离子水冲至柱体积恒定。取3 ku以下牛初乳蛋白片段40 mg，溶解于适量去离子水中，3 mL 上样，去离子水洗脱，流速为1 mL/min 蒸馏水，依次通过Sephadex G-50、Sephadex G-25、Sephadex G-15、Sephadex G-10 细分3 ku以下牛初乳蛋白片段，按照峰型收集。

1.2.4 C18反向柱色谱分离3 ku以下小分子蛋白片段

色谱柱用纯甲醇灌满，冲柱至柱体积恒定，用3 倍柱体积10%甲醇溶液平衡柱子。将样品经0.8 μm 微孔滤膜过滤后上样。用10%甲醇洗脱，流速1 mL/min，连接紫外检测仪在线检测，检测波长为280 nm。

1.2.5 多肽/蛋白质N-端测序分析

将冷冻干燥的牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段经由C18 反向柱层析分离收集峰3 的洗脱液，冷冻干燥。把冻干粉末送中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组学研究分析中心进行多肽/蛋白质N-端测序。

2 结果分析与讨论

2.1 收集从牛初乳中获得不同区段的蛋白样品

每50 mL牛初乳得到样品质量见表1。

表1 50 mL牛初乳得到样品质量

每50 mL 牛初乳经过分离冻干后得到样品总质量为4422.87 mg，从表1 可以看出牛初乳中大部分为大分子量蛋白片段，3 Ku以下蛋白片段不足10%。

2.2 牛初乳中3 ku以下小分子蛋白片段的抑菌试验

图1 牛初乳中3 ku以下小分子蛋白片段的抑菌试验

通过样品对大肠杆菌生长曲线的影响可见牛初乳3 ku 以下区段蛋白具有显著的抑菌效果（见图1），且随着其浓度的增加其抑菌效果也更佳。

2.3 葡聚糖凝胶色谱分离

图2 牛初乳蛋白片段的葡聚糖凝胶色谱分离

由上图可以看出，经由Sephadex G-50 和Sephadex G-25 初步确定峰型后利用Sephadex G-15 和G-10 对3 ku 组分继续分离，得到了比较明确的三个组分（见图2）。

2.4 反相高效液相色谱法分离

图3 反相高效液相色谱法分离3 ku以下小分子蛋白片段

表2 反相高效液相色谱法分离3 ku以下小分子蛋白片段所得各峰面积

结果表明，经C18反相高效液相色谱法分离后，3 ku被分离成4 个部分，按照出峰顺序，分别记为1，2，3，4，收集3号流分并冻干（见图3和表2）。

2.5 多肽/蛋白质N-端测序报告

表3 多肽/蛋白质N-端测序报告

测序报告表明所得到的氨基酸序列为NH2-Y-Q-E-P-V-L-G-P-V，该序列经与网上相关报道(GenBank 序列号：AAA30431.1)比对分析为牛乳中的β-酪蛋白上的片段[10]（见表3）。

牛初乳是自然界中的天然食品，既含有丰富的为身体发育所必需的营养成分，又富含生长因子和免疫因子，对提高机体的免疫力，增强体质，抗炎抗病毒方面具有很强的功效。其中牛初乳中的大分子蛋白乳铁蛋白具有广谱的抗细菌、真菌以及抗病毒和抗肿瘤作用，在抵御病原体侵染、增强机体免疫力等方面具有积极的效果[11]，另外一个大分子物质免疫球蛋白在牛初乳中含量最为丰富，并具有多种生物活性功能，可以约束入侵的细菌、病毒等病原微生物的繁殖，并可以通过刺激引起特殊的反应来帮助机体抵抗疾病，同时免疫球蛋白还具有活化补体、溶解细菌和中和毒素等功能[2]。本实验利用超滤膜法在物理条件下分离得到3 ku 以下牛初乳多肽，发现牛初乳中自然存在的小分子多肽同样具有抑菌作用，为了进一步确认其抑菌作用成分的组成，将3 ku 以下的牛初乳多肽经葡聚糖凝胶色谱 Sephadex G-50、Sephadex G-25、Sephadex G-15 和Sephadex G-10 进行分离，将具有抑菌功效的成分再经C18 反相色谱法分离，根据洗脱下来的峰型收集流分，得到F3组分。

多肽/蛋白质N-端测序分析结果表明，我们得到的3 ku以下牛初乳多肽的氨基酸为NH2-Y-Q-EP-V-L-G-P-V，该序列经网上相关报道比对分析为牛乳中的β-酪蛋白[12]。β-酪蛋白是母乳中蛋白质的主要成分，属于磷酸化蛋白的一种，它占乳蛋白含量的80%，是幼儿或幼崽生长发育主要蛋白来源，具有诱导体内核酸合成，加速体内细胞生长，促进T 细胞成熟，提高免疫力等作用。酪蛋白有4 种主要的组成成分，它们分别是αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，此外还有一些痕量的由β-酪蛋白水解产生的γ-酪蛋白[10，13-14]。酪蛋白是生物活性肽的重要来源，可以通过体内的胃肠消化和食品加工过程中的酶解作用将其释放出来。这些活性肽类包括磷酸肽，抗菌肽，降压肽，和一些具有免疫调节、抗血栓形成以及阿片功能的肽类，从而具有重要而广泛的生物学机能及调节功效[15]。

3 结 论

目前对于动物初乳的研究往往限于其中的大分子生物活性物质，对于天然的小分子物质成分却乏人问津；而与肽相关的报道也往往是针对经过蛋白酶处理后的分解产物[16-17]。本研究在不利用酶解反应的情况下，只通过超滤膜法进行物理分离获得了牛初乳中天然存在的蛋白多肽，并采用检测其对大肠杆菌生长曲线影响的策略验证了所获得的小分子多肽具有一定的抑菌作用，较传统的抑菌圈测定和平板菌落技术等方法简便且高效[17]；而将葡聚糖凝胶色谱及反相色谱法分离得到F3 组分经进一步测序分析后证实为β-酪蛋白上的片段则提示了牛初乳中天然小分子多肽可能具有某些未知的功效，为初乳原料利用率的提高及产品制剂的研发提供了新的思路和依据。