副干酪乳杆菌和马克斯克鲁维酵母混合发酵条件优化

李晏蝶，李珊，高云云，李宝坤

（石河子大学食品学院畜产实验室，新疆石河子832000）

0 引 言

微生物互利共生或共生形式的共生现象[1]在发酵食品中广泛存在，例如在奶酪[2]、酸马奶[3]或酸面团[4-5]中。嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的共生关系在酸奶发酵中得到很好的应用[6]。在人为构建的微生物组合中进行研究可以避免环境与微生物群落背景的复杂性[7-8]。

副干酪乳杆菌在乳制品中作为发酵剂及辅助发酵剂大量使用[9]，马克斯克鲁维酵母是一种普遍存在于天然发酵乳制品中的酵母[10]，混合发酵能够缩短发酵时间[11]、获得高细胞活性[12]、赋予制品独特风味[13]及丰富的营养[14]。利用正交实验优化混合发酵条件，在最优条件下定量几种主要代谢物及风味物质，为复合发酵剂的开发提供基础。

1 实 验

1.1 菌株及试剂

菌株：试验所用菌株为从马奶酒中分离出的1 株副干酪乳杆菌SMN-LBK 和1 株马克斯克鲁维酵母SMN-S7-LBK，由石河子大学食品学院乳制品课题组提供。

培养基：YPD 培养基、MRS 培养基、改良CHALMERS 培养基、脱脂乳粉培养基（脱脂乳粉10%、大豆蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、蔗糖0.5%）在115 ℃高压蒸汽灭菌，pH 自然。

试剂：无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司；酪蛋白，北京奥博星生物技术有限责任公司；结晶紫，天津市天新精细化工开发中心；碘，天津市致远化学试剂有限公司；丁二酮、邻苯二胺、L-酪氨酸、溴化钠、硫脲均由上海麦克林生化科技有限公司提供。

1.2 仪器

全自动新型生化培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；台式高速冷冻离心机，力康发展有限公司；数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；酶标仪，美国BIOTEK 仪器有限公司等。

2 方 法

2.1 菌种的活化

将1 株副干酪乳杆菌与马克斯克鲁维酵母菌分别接种于MRS 培养基在37 ℃下培养16 h 和YPD 培养基中在28 ℃下培养24 h，传代至3代备用。

2.2 生长性能

2.2.1 生长曲线

采用比浊法测定菌株的生长曲线。活化后的乳酸菌、酵母菌以2% 1∶1 的接种量接种于装有150 mL液体培养基的250 mL 锥形瓶中，在32 ℃条件下培养30 h，以2%接种量37 ℃纯培养乳酸菌、28 ℃培养酵母菌为对照，每隔3 h 测定OD600值，绘制OD600值与培养时间的曲线。

2.2.2 活菌数的测定

混合培养使用脱脂乳培养基。将发酵液梯度稀释，选取3 个梯度做3 个重复进行平板菌落计数。单菌培养乳酸菌活菌计数采用MRS 琼脂培养基，单菌培养酵母菌计数采用YPD 琼脂培养基。混菌培养计数乳酸菌选择改良CHALMERS 培养基，混菌培养计数酵母菌使用添加100 mg/L 氯霉素的YPD 固体培养基。计数乳酸菌平板于37 ℃恒温培养箱倒置培养36 h 开始计数，计数酵母菌平板于28 ℃培养48 h 后计数。观察这两株菌是否会在混合培养中显示出与单菌培养显著不同的生长情况，判断这2 株菌间是否存在共生现象，用以建立互作组合。

2.3 条件优化

单因素及其梯度的选择如表1 所示，并根据单因素试验结果设计混合发酵优化条件。

2.4 理化指标

在混合发酵最优条件下测定发酵液pH 值、滴定酸度、酒精体积分数、蛋白酶活、生物膜、柠檬酸、丁二酮、乙醛体积分数，和单菌培养进行对比。

pH 值的测定参考GB 5009.239-2016 pH 计法。

滴定酸度的测定使用酚酞指示剂法[15]。

丁二酮的测定使用邻苯二胺比色法[18]测定丁二酮。

乙醛的测定选用碘滴定法[19]测定乙醛。

2.4.1 酒精体积分数的测定

采用重铬酸钾比色法，取2.5 mL 无水乙醇，加入到100 mL 的容量瓶中，定容成乙醇标准溶液，分别取0、1、2、3、4、5、6、7 mL 乙醇标准溶液于25 mL 比色管中定容，各取出2.5 mL 加入试管，依次加入5 mL 2.0%的重铬酸钾溶液和2.5 mL 98%的浓硫酸混匀，锡箔纸封口，反应10 min，摇匀冷却至室温，以乙醇浓度为零处理标样作为空白，在610 nm 波长下测定各个处理样的吸光度，绘制乙醇标准曲线。发酵液4 000 r/min离心后取出上清液10 倍稀释，处理同上测定OD610，带入标曲计算酒精含量，再根据稀释倍数得到最终发酵液酒精浓度。

2.4.2 蛋白酶活的测定

参考GB/T 23527-2009，制作酪氨酸溶液标准曲线，酪蛋白溶液于40 ℃水浴预热5 min，将发酵液离心上清液10 倍稀释，分别取1 mL 加入试管，在40 ℃水浴中预热2 min，加入1 mL酪蛋白溶液，保温10 min，加入0.4 mol/L 三氯乙酸2 mL，使反应终止，蛋白沉淀后离心过滤，取滤液测OD275，带入标曲求出样品稀释液酶活力，单位u/mL，考虑稀释倍数最终得到样品酶活。

2.4.3 生物膜的测定

选用结晶紫染色法[16]。将 200 μL 菌液加入 96 孔板，调整菌液终浓度为107CFU/mL，用封口膜密封后于30 ℃培养24 h；将板内菌液吸弃，250 μL 生理盐水洗2 遍，每次洗菌完成后吸弃；加入200 μL 99%甲醇固定15 min，吸弃甲醇，室温干燥；加入200 μL 2%结晶紫溶液染色5 min，吸弃结晶紫染液，生理盐水洗2遍，室温干燥；加入220 μL 33%乙酸溶解混匀；酶标仪检测OD570值。每个样本做3个重复。

2.4.4 柠檬酸的测定

选取五溴丙酮法排除杂酸干扰[17]，将发酵液的离心上清液稀释100倍，取1 mL稀释液加入比色管，加入1 mL 10%HPO3冰浴1 min，再加入2 mL KMnO4-NaBr溶液冰浴10 min，然后滴加3%H2O2至褪色，加入1.5 mL 正庚烷充分振荡，静置分层后取1 mL 上层有机相加入3.5 mL 硼酸钠-硫脲试剂充分混匀，静置分层后取下层溶液于445 nm 测定吸光值，1 mL 正庚烷加3.5 mL 硼酸钠-硫脲试剂涡旋后取下层无机相作为空白对照，代入柠檬酸标准曲线得到稀释液柠檬酸含量，考虑稀释倍数得到最终浓度，结果取3 次重复的平均值。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验

由于菌株的最适生长温度、生长周期不同，且菌的接种量与接种比例直接影响乳酸菌和酵母菌互作，所以选择发酵温度、发酵时间、接种量、接种比例四个因素进行单因素试验，为正交试验选择因素水平。

3.1.1 发酵温度对混合培养活菌数的影响

在酵母菌和乳酸菌最适生长温度间设计混合发酵温度梯度，分别计数不同温度下混合发酵的乳酸菌及酵母菌活菌数。

图1 单菌培养和共培养生长曲线

图2 发酵温度对混合培养活菌数的影响

如图2 所示，随着温度逐渐升高至乳酸菌的最适生长温度，其活菌数不断增加，酵母则随着温度升高远离酵母生长最适温度而活菌数大致呈现减少趋势。在32 和34 ℃下混合发酵乳酸菌与酵母菌活菌数都比较高，可用于互作现象观察的培养温度。对不同发酵温度下活菌数进行单因素方差分析结果差异不显著。

3.1.2 接种量对混合发酵的影响

选择适宜的接种量范围设计混合发酵接种量梯度，分别计数不同接种量下混合发酵的乳酸菌及酵母菌活菌数，如图3所示。

图3 接种量对混合发酵的影响

由图3 可以看出，乳酸菌随着混合发酵接种量的增大活菌数先增加后减少，接种量越多，乳酸菌因群体感应能更快的适应环境快速的生长，但当接种量大到一定程度，乳酸菌间会因为竞争营养和生存空间导致乳酸菌的活菌数反而下降[20]。酵母活菌数随着接种量的增加反而减少，在所选的接种量范围内一开始就表现出对生长环境的竞争。乳酸菌在较大接种量下活菌数依然较大，可能是由于酵母代谢物为乳酸菌的生长提供营养起到促进作用，而乳酸菌对酵母的促进作用有限反而更容易表现出对生长环境的竞争导致酵母活菌数下降。

3.1.3 接种比例对混合发酵的影响

分别计数不同接种比例下混合发酵的乳酸菌及酵母菌活菌数，结果如图4所示。

图4 接种比例对混合发酵的影响

图4 中，当接种比例为1∶2 时，乳酸菌的活菌数较低，酵母菌活菌数较高，酵母菌的接种量多则能够快速适应环境进入生长；当接种比例为2∶1 时，乳酸菌接种量较多利于活菌数增长，酵母菌需要更长的时间适应环境而活菌数较少；在接种比例为1∶1 时，乳酸菌和酵母的都具有最高的活菌数，共生促进生长作用大于起始菌数的影响，此接种比例对于混合发酵较为合适。

3.1.4 发酵时间对混合发酵的影响

2 株菌进入对数末期时间大致相同，为积累混合发酵代谢产物，从24 h 开始分别计数不同发酵时间下混合发酵的乳酸菌及酵母菌活菌数，结果如图5所示。

图5 发酵时间对混合发酵的影响

图5 中，酵母的生长周期长于乳酸菌，乳酸菌单独培养12 h 就能达到稳定期，而酵母菌24 h 活菌数才能达到最大，混合发酵后进行代谢物检测，需要适当延长混合发酵时间确保同时达到乳酸菌和酵母生长的稳定期。所以混合发酵计数乳酸菌发酵时间选择为24 h，混合发酵计数酵母菌发酵时间为36 h 较为合适。乳酸菌单独培养到24 h 大致进入衰亡期，但由于添加了酵母混合发酵，乳酸菌的衰亡期推后，能与酵母菌同时达到较高的活菌数[21]。

3.2 正交实验

根据单因素实验结果，选择接种量、接种比例、发酵时间3 个因素设计3 因素3 水平正交试验优化混合发酵条件，由于酵母极显著促进乳酸菌生长，所以将乳酸菌活菌数作为Y 值，期望混合发酵乳酸菌的活菌数达到最大，利于从营养代谢角度考察酵母菌对乳酸菌的促进作用。

表2 混合发酵条件优化结果

根据表2 混合发酵优化结果进行多元线性回归分析，得到接种量（A）、接种比例（B）、发酵时间（C）对混合发酵中乳酸菌活菌数的回归方程为：Y=5.87778-0.777778A1+0.455556A2-0.577778B1-0.511111B2-0.0777778C1-1.077778C2。相关系数R=0.98084，决定系数R2=0.96204；调整相关系数R=0.92095，调整决定系数R2=0.84816。表明该多元回归模型能较好的拟合试验中Y 值的变化，进而预测混合发酵中乳酸菌活菌数变化。

表3 正交实验方差分析

根据表3，混合发酵中影响因素的重要性排序为C＞B＞A。比较9 次因素的不同水平组合，混合发酵计数乳酸菌最优条件组合为A3B2C1，乳酸菌活菌数达到7.5×108CFU/mL，对应的混合发酵条件：接种量为5%，乳酸菌与酵母1∶1 混合发酵24 h。正交实验最优组合应为A2B2C3，进行验证，最优条件最终确定为混合发酵以4%的接种量，1∶1比例接种，发酵时长28 h。混合发酵使乳酸菌活菌数较高且使衰亡期的到来延滞。

在脱脂乳培养基中对副干酪乳杆菌和马克斯克鲁维酵母进行混合发酵，将MRS 培养基单菌培养乳酸菌和YPD 培养基单菌培养酵母当作对照，马克斯克鲁维酵母对副干酪乳杆菌的促进作用显著，活菌数（对数值）从7.88 CFU/mL 增长到8.87 CFU/mL；副干酪乳杆菌对马克斯克鲁维酵母促进作用不显著，活菌数从7.33 CFU/mL增加为7.42 CFU/mL。

3.3 理化指标

对各项理化指标的检测及差异显著性分析如表4所示。

表4 理化指标测定结果

脱脂乳培养基中碳源主要为乳糖，乳糖代谢产生乳酸，乳酸能够影响发酵液酸度变化。乳酸的产生通过糖酵解途径，葡萄糖在不需氧的条件下在乳酸菌细胞胞浆内分解成丙酮酸进而被还原成乳酸。乳酸菌与酵母混合发酵，将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖的β-半乳糖苷酶和将丙酮酸转化为乳酸的乳酸脱氢酶活性提高，糖酵解途径关键限速酶——HK 和PK 活力增加，乳酸含量会增加[22]。混合发酵测得pH 值高于单菌培养乳酸菌，可能是由于产生的乳酸与乙醇生成乳酸乙酯，从而使乳酸含量下降，pH 值上升[23]。

乳酸菌与酵母混合发酵中酒精含量高于酵母单菌培养，可能是由于混合发酵中乳酸菌为酵母提供较YPD 培养基更为丰富的碳源利于酵母产酒精。副干酪乳杆菌SMN-LBK 除了生成乳酸外还能生成乙醇等物质，是异型乳酸发酵，但耐乙醇力低于酵母，底物范围窄。发酵过程中添加酵母菌能够促进发酵乳中牛血清蛋白、α-酪蛋白、β-乳清蛋白降解[24]。尽管副干酪乳杆菌SMN-LBK 自身产蛋白酶，马克斯克鲁维酵母的高酶活会为其提供更为丰富的氮源，利于乳酸菌生长。混合发酵对副干酪乳杆菌生物膜形成有促进作用，对马克斯克鲁维酵母生物膜形成影响不大。混合发酵中柠檬酸、丁二酮、乙醛含量均高于单菌发酵，有助于改善发酵乳制品的风味[25]。

副干酪乳杆菌和马克斯克鲁维酵母的互作组合构建，从碳源、氮源代谢的角度为其他互作组合的选择提供依据，副干酪乳杆菌SMN-LBK 具有良好蛋白酶活性，不依赖酵母提供氮源，属于异型乳酸发酵，可以产生乙醇，既可以产生柠檬酸又可以代谢柠檬酸；而马克斯克鲁维酵母SMN-S7-LBK 能够发酵乳糖，不依赖乳酸菌分解乳糖产生可利用碳源，并具有高蛋白酶活。这2株菌间存在着代谢物的相互利用关系。

4 结 论

混合发酵提高乳酸菌活菌数的最优条件为：接种量4%，接种比例1∶1，发酵时间28 h。混合发酵中酵母对乳酸菌生长表现出极显著的促进作用，使乳酸菌活菌数（对数值）从7.88 CFU/mL增加至8.87 CFU/mL，乳酸菌对酵母的促进作用则不显著。混合发酵酸度低于乳酸菌单菌发酵，混合发酵的蛋白酶活提高，酒精、柠檬酸、丁二酮、乙醛含量增加，能够促进乳酸菌生物膜形成。这对马克斯克鲁维酵母和副干酪乳杆菌间可以建立微生物共生模型，具有制作复合发酵剂的潜力。马克斯克鲁维酵母SMN-S7-LBK 对碳源利用更为广泛，它是否可以解除葡萄糖抑制效应，优先利用半乳糖，同时也能利用葡萄糖，以实现既不影响自身生长还能利于乳酸菌增长[26]，这也是此类互作组合模型未来的一个研究方向。