全国1 200例VVC致病菌的常见抗真菌药物MIC分析

白会会，宗晓楠，范琳媛，刘朝晖

(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院1.检验科；2.妇科，北京 100026)

外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是常见的妇女外阴阴道炎症之一[1]。有75%的妇女一生中至少有1次VVC发作，40%～45%的女性会出现第2次VVC感染，5%的妇女VVC反复发作[2-3]。有研究表明，每年有1.38亿妇女患复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)，超过3.7亿妇女一生中遭遇其困扰[4]。近年来，尽管已有一些抗真菌药物对VVC疗效方面的研究，但都是基于单个医院或区域性的研究数据，还未见关于VVC致病微生物的全国范围内的流行病学研究，也没有全国范围内关于抗真菌药物对导致VVC阴道致病真菌的敏感性比较研究。为填补这方面的研究空缺，更好地给予临床指导性建议，本文对1 200例VVC致病菌的常见抗真菌药物MIC值进行了研究，现报道如下。

1材料与方法

1.1样本来源

本次样本来源于2015年全国妇科门诊抗真菌感染健康项目，其为目前国内距今最近的全国性流调项目。研究中共纳入全国45家医院，分布于我国北部、东部、西部、中部和南部各个地域。本研究经各参与医院伦理委员会批准后开始实施，共纳入妇科门诊就诊的VVC患者资料1 200例，患者年龄为18～60岁，平均年龄(32.36±8.35)岁。经患者知情同意后，收集其阴道分泌物，从中分离培养得到1 200株假丝酵母菌菌株。

1.2菌株复苏

将-80℃冰箱中保存的菌株恢复至室温，接种环挑取菌液划线接种于沙保弱培养基，置于37℃的真菌培养箱24～48小时，若见乳酪样菌落生长为培养阳性。

1.3菌株鉴定

接种针挑取菌落，接种于科玛嘉假丝酵母菌显色培养基，置于37℃真菌培养箱培养24～48小时，观察菌落颜色。一般情况下，绿色或翠绿色，直径约2mm的菌落为白假丝酵母菌；蓝灰色或铁蓝色，直径约1.5mm的菌落为热带假丝酵母菌；粉红色，直径约4～5mm的扁平、表明粗糙、边缘模糊、有微毛的菌落为克柔假丝酵母菌；紫色，表面光滑湿润、直径约2mm的菌落为光滑假丝酵母菌；白色菌落常为其他假丝酵母菌。

1.4体外药敏试验

参照2010年美国临床实验室标准化协会(Clinical & Laboratory Standards Institute，CLSI)M27-A3真菌药物敏感性实验指南中的微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(minimal inhibition concentration，MIC)[5]，所用药品来自中国食品药品检定研究院，使用的抗真菌药物有克霉唑(货号：100037)、氟康唑(货号：100314)、咪康唑(货号：100213)、伊曲康唑(货号：100631)及制霉菌素(货号：130375)。

1.4.1菌悬液的制备

将菌株接种至沙保弱培养基上，置37℃真菌培养箱孵育24小时。挑取生长24小时、直径约1mm的假丝酵母菌菌落3～5个，悬浮于2mL 8.5g/L无菌氯化钠溶液中，调整其浊度达到0.5麦氏标准，相当于(1～5)×106/mL个菌细胞。用孢子相液基1∶2稀释后，再1∶1 000稀释，使其浓度为(0.5～2.5)×103个菌细胞(CFU)/mL。

1.4.2抗真菌药液的制备

实验时，将储存液解冻后分别用培养基倍比稀释，氟康唑的质量浓度为64～0.125μg/mL，咪康唑、伊曲康唑、克霉唑及制霉菌素的质量浓度为16～0.03μg/mL，同时保证CLSI M27-A3方案要求的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)最高接种浓度不超过1%。

1.5结果判定

药物MIC终点判定：以80%受抑制为判定终点，肉眼判断结合凝胶成像仪拍摄(酶标仪)得到最终结果。

1.6质量控制

以白假丝酵母菌ATCC 22019和ATCC 6258为质控株进行质量控制。

1.7统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件处理数据。计数资料以例数(百分率)[n(%)]表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法进行统计分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1菌株分类情况

在1 200例VVC致病菌株中，81.17%(974/1 200)为白假丝酵母菌，而非白假丝酵母菌仅占18.83%(226/1 200)，其中以光滑假丝酵母菌为主，占13.25%(159/1 200)，见表1。

表1 真菌菌株分类构成Table 1 Classification of fungal strains

2.2白假丝酵母菌与非白假丝酵母菌的不同抗真菌药物MIC值的分布

白假丝酵母菌与非白假丝酵母菌的氟康唑、克霉唑、咪康唑、伊曲康唑及制霉菌素不同MIC值分布的比较差异均有统计学意义(P<0.05)；白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌对氟康唑的耐药性均较高，MIC≥64μg/mL比例分别为73.41%和50.88%；而白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌对于制霉菌素MIC低值比例均较高，MIC≤1μg/mL比例分别为79.67%和76.11%；白假丝酵母菌对于克霉唑MIC低值比例高于非白假丝酵母菌；白假丝酵母菌对于咪康唑MIC低值比例低于非白假丝酵母菌；而白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌对于伊曲康唑MIC高值比例均较高，MIC≥16μg/mL比例分别为43.12%和25.66%，见表2。

表2 白假丝酵母菌与非白假丝酵母菌的不同抗真菌药物MIC值分布的比较[n(%)]Table 2 Comparison of MIC distributions of different antifungal drugs between Candida albicans and non-Candida albicans[n(%)]

(转下表)

3讨论

3.1白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌在VVC致病中的差异

VVC是由于假丝酵母菌的定植和大肆繁殖所致，其菌种大多为白假丝酵母菌。Corsello等[6]研究了909例培养阳性的VVC菌群分布，其中白假丝酵母菌占77.1%，光滑假丝酵母菌占14.6%。本团队曾报道过北京地区VVC患者致病菌种类的分布，白假丝酵母菌占76.65%，光滑假丝酵母菌占17.65%，与上述研究结果[7]基本相符。近期，国外一项纳入93 775位女性的研究数据显示，在VVC的致病微生物中，白假丝酵母菌占89%，光滑假丝酵母菌占9%，其它小于2%[8]。而本研究显示，有81.17%的致病菌株为白假丝酵母菌，18.83%为非白假丝酵母菌，其中以光滑假丝酵母菌为主，占13.25%。有研究提示，目前非白假丝酵母菌在VVC中比例升高，而本研究中并未观察到这一现象，这可能与研究对象的选择有关。有研究提示，广泛使用非处方药、长时间应用抑制性唑类药物，均可能导致非白假丝酵母菌比例升高，因此临床中规范合理使用抗生素尤其重要[9]。

临床和基础研究数据均显示，非白假丝酵母菌感染的患者不仅临床症状较轻，且患者阴道微生态失调程度较低，合并其他阴道炎症如细菌性阴道病(bacterial vaginosis，BV)的比例通常较低。然而，由于非白假丝酵母菌常常以孢子形式存在，其对常见的临床药物敏感性低，难以彻底清除，因此一般需加长药物使用时间，而长期低剂量抗菌药物的使用更易导致广泛产生耐药[10-11]。因此，比较分析白假丝酵母菌与非白假丝酵母菌对临床常见抗真菌药物的敏感情况，选择性地使用抗真菌药物，以减少耐药菌的产生，成为临床研究的重点。

3.2白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌对5种抗真菌药物MIC值分布具有很大差异

本研究纳入全国1 200例VVC患者，分析比较临床常用的5种抗真菌药物对患者阴道中假丝酵母菌MIC值分布情况。研究采用微量稀释法测定MIC值，MIC值代表该药物抑制真菌生长的最小浓度，MIC值的高低可以反映菌株对于药物的敏感耐药情况。本研究结果显示，白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌对于氟康唑、克霉唑、咪康唑、伊曲康唑和制霉菌素5种抗真菌药物MIC值分布情况均不同，且差异均有统计学意义。对于克霉唑，白假丝酵母菌的MIC低值比例更高，而非白假丝酵母菌的MIC高值比例更高，提示白假丝酵母菌对克霉唑的敏感性可能更好，而非白假丝酵母菌可能对克霉唑存在较高比例的耐药；对于咪康唑，白假丝酵母菌的MIC高值比例更高，非白假丝酵母菌的MIC低值比例更高，提示非白假丝酵母菌较白假丝酵母菌对咪康唑敏感性更高，对于非白假丝酵母菌引起的VVC，咪康唑有效性可能更高。

本研究显示，对于氟康唑，白假丝酵母菌MIC≥64μg/mL的比例高达73.41%，非白假丝酵母菌MIC≥64μg/mL的比例也达50.88%，表明目前全国VVC患者对氟康唑出现一定的耐药性，且白假丝酵母菌所致的VVC患者耐药比例更高，提示在针对VVC治疗时，应慎重使用氟康唑和伊曲康唑。此外，白假丝酵母菌对于伊曲康唑的耐药性也较高，MIC≥16μg/mL比例为43.12%。本研究还显示，白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌对于制霉菌素MIC低值比例均较高，且对制霉菌素MIC高值比例均较低，提示1 200株菌株对制霉菌素可能比较敏感。

综上，VVC的主要致病菌仍是白假丝酵母菌，光滑假丝酵母菌已成为白假丝酵母菌以外的VVC第2大致病菌。白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌患者对5种抗真菌药物的MIC值分布具有明显差异。目前全国VVC患者对氟康唑耐药性较高，临床中应谨慎使用。白假丝酵母菌致VVC患者对克霉唑和制霉菌素敏感度较高，非白假丝酵母菌致VVC患者对咪康唑和制霉菌素的敏感度较高。因此，针对不同的真菌应选择性使用抗真菌药物。