不明原因反复胚胎种植失败与子宫内膜CD38、CD138 表达的相关性

万瑞雪，陈静思，别 嘉，苏 娅，孟昱时

（1） 昆明医科大学第一附属医院生殖医学科，云南昆明 650032；2） 昆明医科大学第二附属医院生殖医学科，云南昆明 650101）

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET） 技术的不断进步使不孕症患者的临床妊娠率大大提高，但仍有部分女性在接受多次胚胎移植后仍为获得临床妊娠，反复种 植 失 败 （recurrent implantation failure，RIF）现在是辅助生殖技术发展中遇到的难点问题，在辅助生殖助孕中RIF 发生率约为10 %[1-3]。目前RIF 的定义尚未统一，一种是至少2 次胚胎移植未获得妊娠者，另一种是进行了至少3 次胚胎移植未获得妊娠者，而现在仅2 次胚胎移植后未获得妊娠者被大部分RIF 治疗方法的实验研究作为研究对象[4]。RIF 病因尚未明确，排除胚胎染色体异常外现已阐明的部分如淋巴细胞亚群比例和功能失调、母体中自身抗体、促炎因子浓度升高均可以影响子宫内膜容受性和胚胎发育，使患者发生RIF。子宫动脉重铸不足和血栓前状态也一样影响胚胎着床[5]。

近年来多项研究表明子宫内膜炎性改变与女性不孕、反复流产患者存在相关性。慢性子宫内膜炎（chronic endometrial，CE） 是指持续存在的子宫内膜炎症，一般人群中的CE 患病率现不明确，大概0.8%～27.1%，但在不孕患者中明显升高，约2.8%～26.8%，在复发性流产患者中的发病率高达9.7%～67.6%[6-9]。但是探讨CE 与RIF 的关系的研究并不多，根据其病理状况可以考虑CE 和RIF 的发生可能有一定的联系，因此，本研究旨在探讨RIF 与子宫内膜CD38、CD138 表达的相关性，从而探究RIF 的发生是否与CE 的存在相关性，为更全面的思考RIF 的病因和治疗方案提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2017 年1 月1 日至2017 年12 月31 日在昆明医科大学第一附属医院生殖医学科行IVF-ET多次种植失败的患者72 例。

纳入标准：RIF 组为多次移植的胚胎数量≥10个或移植了至少两次优质胚胎仍未获妊娠患者，且年龄≤37 岁。对照组为男性因素不孕，第一周期行IVF-ET 获得妊娠者，且年龄≤37 岁。所有患者均在IVF-ET 前一周期自愿接受宫腔镜检查并签署知情同意书。

排除标准:影响胚胎着床的因素如输卵管积水、生殖系统解剖结构异常、自身免疫性疾病、卵巢功能不良、内分泌疾病等。

1.2 子宫内膜组织获取

所有患者均在月经干净3～7 d，在常规消毒下刮取性宫腔镜检查并刮取子宫内膜，排除宫腔粘连、内膜息肉、纵隔子宫及其他解剖结构异常。刮取的内膜组织立即放入70%乙醇固定液中，24 h内行常规脱水，石蜡包埋，切片，分别行HE 染色和S-P 免疫组化染色。

1.3 子宫内膜组织学观察及CD38、CD138 的测定

1.3.1 阅片观察间质细胞的CD38、CD138 染色是否阳性，并计数每个高倍视野阳性细胞数。记录：记录所观察的数据及患者子宫内膜组织病理学诊断。

1.3.2 CD38、CD138 阳性的判读标准浆细胞胞膜在CD38、CD138 免疫组化染色后可显示强阳性，胞质染色后则显示为弱阳性，视野下可见到细胞质呈嗜碱性，染色质粗，沿核膜呈辐射状排列成车轮状，核圆但偏于细胞一侧。慢性子宫内膜炎的诊断为每400 倍高倍镜视野下，子宫内膜间质中见到5 个或以上典型的浆细胞。

1.4 统计学处理

统计分析采用SPSS 软件包进行，计量资料符合正态分布以均值±标准差表示，采用两独立样本t检验进行比较，计数资料用率表示，采用卡方检验比较，定性变量分布的比较采用卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 比较RIF 组及对照组患者一般情况

两组年龄、BMI、基础FSH、HCG 日内膜厚度差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1，具有可比性。

表1 RIF 组与对照组一般情况比较（）Tab.1 General characteristic’s comparison of RIF and control group （）

表1 RIF 组与对照组一般情况比较（）Tab.1 General characteristic’s comparison of RIF and control group （）

2.2 两组患者宫腔镜检查及常规病理检查的比较

在72 例RIF 患者中，有5 例宫腔镜手术医师在术中见内膜间质水肿伴充血，提示子宫内膜炎可能；41 例对照组患者中有2 例术中可见内膜水肿伴散在微小乳头状突起，提示子宫内膜炎可能，两组差异不具有统计学意义（P＞0.05）。两组患者常规病理报告均提示增生期或分泌期子宫内膜，未见异常病理报告。

2.3 子宫内膜CD38、CD138 阳性表达率与不明原因RIF 的相关性

72 例RIF 患者中共41 例CD38 表达为阳性（占56.9%）；共42 人CD138 表达阳性（占58.3%）；共48 例CD38 或CD138 表达阳性（占66.7%）。41 例对照组患者中共15 例CD38 表达阳性（占36.6%）；共16 例CD138 表达阳性（占39.0%）；共18 例人CD38 或CD138 表达阳性（占43.9%）。RIF 组CD38 阳性表达率及CD138 阳性表达率均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；RIF 组CD38 或CD138 阳性表达率也高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 RIF 组与对照组子宫内膜CD38、CD138 阳性表达率的比较［n（%）］Tab.2 Expression rate of endometrium CD38 and CD138 in RIF and control group ［n（%）］

2.4 子宫内膜CD38、CD138 阳性表达率与不同种植失败次数的相关性

RIF 患者中共37 例胚胎种植失败2 次，其中共16 例CD38 表达阳性（占43.2%）；共17 例CD138 表达阳性（占45.9%）；共18 例CD38 或CD138 表达阳性（占48.6%）。胚胎种植失败3 次的患者共24 例，其中共15 例CD38 表达阳性（占62.5%）；共17 例CD138 表达阳性（占70.8%）；共19 例CD38 或CD138 表达阳性（占79.2%）。种植失败次数大于3 次的患者共11 例，其中10 例CD38 表达阳性（占90.9%）；8 例CD138 表达阳性（占72.7%）；共11 例CD38 或CD138 表达阳性（占100%）。

不同种植失败次数患者组间比较，随种植失败次数增加CD38 及CD138 的阳性表达率也增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；同时随种植失败次数的增加CD38 或CD138 的阳性表达率也增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同种植失败次数患者CD38、CD138 阳性表达率的比较［n（%）］Tab.3 Comparison of different time's implantation failure patients with CD38 and CD138 expression rate ［n（%）］

2.5 CD38、CD138 细胞表达量与不同胚胎种植失败次数的相关性

对种植失败2 次、3 次、＞3 次三个组的阳性细胞表达量分为＜100 个、100～300 个、＞300 个三个水平，行秩和检验显示种植失败次数越多CD38、CD138 阳性细胞表达量就越高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

采用秩和检验行3 组的组间比较，种植失败大于3 次的CD38、CD138 阳性细胞表达量均高于种植失败3 次组和种植失败2 次组，差异具有统计学意义（P＜0.05） ；种植失败2 次与3 次间阳性细胞表达量不具有统计学差异（P＞0.05）。

表4 不同种植失败次数患者CD38、CD138 表达量的比较Tab.4 Comparison of expression level of CD38 and CD138 in patients with different time's implantation failur

3 讨论

在IVF-ET 周期中RIF 的患病率约10%，但RIF 的定义现尚未统一，欧洲人类生殖和胚胎学在2005 年将RIF 定义为累积移植大于等于10 枚高质量胚胎均未着床，或胚胎植入3 次以上为着床者；本研究中选择了至少2 次胚胎移植，有优质胚胎而未获得妊娠者作为研究对象。

现有的研究将RIF 的病因归纳为胚胎因素、免疫、代谢、凝血、子宫解剖结构异常几个方面[10]，排除母体免疫、凝血等问题后CE 引起的胚胎种植失败近年来得到了生殖医学专家的关注。子宫内膜炎的主要发病原因是病原微生物感染，但急性子宫内膜炎与CE 是不同的治病原体感染引起，现运用基因组学、微生物组学技术可以有效的检测CE 的致病原体[11]。存在炎症的子宫内膜都有浆细胞浸润和IgM、IgG 和IgA 抗体的分泌，这些炎性因子的存在改变子宫内膜的免疫环境，从何产生的免疫反应和炎症反应会杀灭精子并呈现出胚胎毒作用，导致子宫内膜容受性下降，不利于胚胎的种植和发育。除此之外近期国外学者研究发现CE 也可能通过影响间质细胞蜕膜化从而影响胚胎植入[12]。因此早发现、早治疗CE 对改善不孕、复发性流产及RIF 患者的妊娠结局是有帮助的。

现国内外学者对RIF 的病因研究多关注免疫、凝血等方面的因素，因CE 常无特异性的临床表现，有时会忽略了CE 引起的RIF。本研究中在宫腔镜检查中及常规病检HE 染色均显示RIF 组与对照组患者间的异常率无统计学差异，可见单纯在宫腔镜检查中依靠肉眼辨识及传统HE 染色的方法无法提高CE 的检出率。CE 在宫腔镜下的表现为子宫内膜间质水肿，可见＜1 mm 的微小息肉及局部或散在的内膜充血[13]。CE 在HE 染色镜下可见内膜增多和扩张的血管，存在浸润在间质中的浆细胞及淋巴细胞。但由于内膜中白细胞的存在干扰及以及组织切片中细胞着色不足等原因，子宫内膜间质中的单核细胞、成纤维细胞在常规的HE染色中难以和浆细胞区分[14]。因此CE 的诊断需要寻找特异性高的标志物。

目前大量研究表明CD38，CD138 是浆细胞中最特异性表达物。使用免疫组织化学染色检测二者能大幅度提高浆细胞的检出率，优于传统的HE染色[15]。因此子宫内膜是否有炎性改变可以用CD38、CD138 免疫组化染色来检测，最终提高CE的确诊率[16]。但目前通过检出浆细胞诊断CE 还不足够为CE 的治疗提供依据，同时进行微生物组学检测可以确认内膜微生物群成分，有助于明确微生物对内膜产生的免疫机制及导致CE 发生的机制，并对使用针对性的抗生素治疗CE 起到指导作用[17]。

本研究通过CD38、CD138 细胞在RIF 患者子宫内膜中的阳性表达，研究发生RIF 与子宫内膜CD38、CD138 阳性表达的相关性，从而对RIF 与子宫内膜炎性改变的关系进行探讨。研究结果显示对照组子宫内膜中CD38、CD138 的阳性表达率低于RIF 组，并且在RIF 的患者中子宫内膜CD38、CD138 的阳性表达率就越高种植失败的次数也就越多。再比较RIF 组CD38、CD138 的阳性细胞表达量，结果显示种植失败＞3 次的患者阳性细胞表达量明显高于种植失败2 次和3 次的患者。由此说明子宫内膜CD38、CD138 的阳性表达与RIF 的发生存在相关性，也从而证实了RIF 与CE有关，并且子宫内膜炎性改变的程度越重则胚胎反复种植失败的次数越多，即胚胎种植越难。

根据现有的研究可以证实CE 和RIF 的发生存在相关性，那么对存在CE 的RIF 患者进行治疗后对助孕结局是否有改善呢? Cicinelli、Mettao[18]等根据子宫内膜微生物的培养结果对伴有CE 的RIF 患者使用相应抗生素进行单独或联合用药治疗，结果显示使用抗生素治疗1～3 个疗程后治愈CE 的患者人数为28%、23%和25%，剩余25%患者产生耐药。抗生素治疗后再次行新鲜胚胎移植的活产率治愈组（60.9%） 高于持续CE 组（13.3%）。Hartnett J[19]等对伴有CE 的RIF 患者使用多西环素治疗后，免疫组化检查发现CD138 基质中浆细胞清除率达70%，治愈组第一周期移植活产率32.8%，3 个累积移植周期活产率为38.8%。现抗生素治疗以及是治疗CE 的一线方式，我中心现使用甲硝唑和地塞米松宫腔上药联合口服抗生素的治疗方案对RIF 伴CE 的患者进行治疗，本研究入组患者治疗后第一周期胚胎移植临床妊娠率为35.4%（17/48），因部分患者失访及依从性较低未能统计活产率及累积妊娠率。除抗生素作为一线治疗方式，部分临床医生使用中药或联合物理治疗CE，也可以使RIF 及RSA 患者获得理想的妊娠结局。

综上所述，不明原因反复胚胎种植失败与子宫内膜CD38、CD138 的阳性表达具有相关性；且反复种植失败次数越多，CD38、CD138 阳性表达率及细胞表达量就越高；对不明原因反复胚胎种植失败的患者通过免疫组化染色检测子宫内膜CD38、CD138 的表达，有助于确诊CE 引起的RIF。确诊后使用抗生素同时联合物理及中药治疗有利于改善RIF 患者的妊娠结局。但本研究样本量有限，可能存在一定的局限性，今后还需要扩大样本量进一步研究。