Corilagin 对家兔动脉粥样硬化斑块及ox-LDL 损伤的血管内皮细胞TLR4 表达的影响

刘 韬 ，吴希军，朱万芸，陈建雯，阳 敬，沈志强，刘 光，柴文英，陈 鹏

（1） 红河卫生职业学院药学系，云南红河 661100；2） 五莲县康复医院，山东日照 262300；3） 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明 650500；4） 昆明医科大学第一附属医院乳腺外科，云南昆明 650032）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 作为一种慢性炎性疾病，是大多数心脑血管疾病的共同病理基础，不稳定的粥样斑块一旦破裂或者斑块募集血小板等血细胞而形成血栓，则有可能导致缺血性心脑血管事件，也是最常见的死亡原因之一[1]。其复杂多阶段性病理过程给临床治疗带来了困难。有研究指出，Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）与动脉粥样硬化形成过程密切相关，其中TLR4 在人体冠状动脉斑块中表达较为明显[2]。TLR4 能够识别细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 介导炎症信号转导，参与免疫应答的启动过程，促进炎症的发生发展[3]。有研究表明，动脉内皮细胞表达的TLR4 主要与动脉粥样硬化有关，而静脉内皮细胞表达的TLR4 更可能与感染性心肌病和充血性心力衰竭有关[4]。因此，TLR4 对AS 的发生起到了重要的作用。目前，AS 常用的化学治疗药物有他汀类、抗血板和抗血脂药等，但预后不太理想，存在一定的不良反应。因此，迫切需要寻找和开发疗效确切、不良反应较小的天然药物。

Corilagin （结构式见图1） 作为一种多酚类化合物，可以从滇产特色植物药苦味叶下珠中提取分离，不良反应小，临床应用日趋广泛[5]。本项目组前期研究发现，Corilagin 可通过有效抑制中性粒细胞与血小板之间的相互作用、降低C 反应蛋白（CRP） 和氧化低密度脂蛋白受体-1（LDL-1） 的表达、降低细胞内钙离子浓度、影响细胞周期和增殖、保护血管内皮细胞和抑制血管平滑肌细胞增殖迁移等机理发挥抗AS 作用[5-8]。本研究拟复制家兔动脉粥样硬化模型和用ox-LDL 损伤人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），探讨Corilagin 对TLR4 蛋白及mRNA 表达的影响，为进一步研究抗AS 新型药物提供理论和实验依据。

图1 Corilagin 化学结构式Fig.1 Chemical structure of corilagin

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

Corilagin 由中科院昆明植物研究所提供，分子式为C27H22O18，纯度99%，分子量634.5，无臭、黄褐色粉末。辛伐他汀，上海信宜万象药业有限公司提供，纯度＞99%，分子量418.6。维生素E 原粉购于Sigma 公司，避光干燥保存。

高脂饲料：84.5%基础饲料中加入10%猪油，4%蛋黄粉，1.5%胆固醇，本实验室配制。Ox-LDL，广州奕源生物科技有限公司。胎牛血清和DMEM 培养基属美国Gibco 公司产品。Golden Taq PCR 试剂盒，TRNzol-A+总RNA 提取试剂裂解液和BCA 蛋白检测试剂盒均属天根生化科技（北京） 有限公司产品；TLR4 和β-actin 一抗及二抗羊抗兔均从美国Abmart 公司购得；Purelink TM基因组DNA 小量提取试剂盒，Superscript III cDNA合成试剂盒，引物，Platinum SYBR Green qPCR 试剂盒，购自美国Invitrogen 公司；胶片购自柯达公司，蛋白印迹实验的发光底物属Thermo 公司产品。

1.2 实验动物和细胞

清洁级新西兰白兔，雌雄各半，体重1.8～2.2 kg，由昆明医科大学实验动物学部提供，合格证号：SCXK（滇） 2005-0008。人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 系购自中国典型物保藏中心（Cell Line Designation:HUV-EC-C ATCC Catalog No.CRL-1730），本次实验选择生长良好的4-8 代细胞用于实验。

1.3 主要仪器

蛋白定量仪（德国Thermo 公司）、垂直电泳仪和Mini Protein-3 型膜转印装置（美国Bio-rad 公司），WD-9405 型水平脱色摇床，WH-986 型静音混合仪（北京六一仪器厂），Leica RM2135 切片机（德国Leica 公司），全自动凝胶图像分析系统（美国Bio-rad 公司）；核酸定量仪（德国Thermo 公司），TPC-0220G 型PCR 扩增仪，7500 型荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。

1.4 方法

1.4.1 实验分组及高脂喂养致家兔AS 模型将家兔随机分为正常对照组、模型对照组、2.5 mg/kg辛伐他丁阳性对照组、1 mg/kg、2 mg/kg 和4 mg/kg Corilagin 组，10 只/组。

动物均分笼单只饲养，实验前先适应性饲养1周。正常对照组正常饲养，不做任何处理；其余各实验组饲喂高脂饲料，自由饮水。12 周后，每组各抽取2 只动物处死，取主动脉血管进行病理学检查。显微镜下可见增厚的血管内膜，血管内皮细胞排列不整齐、不连续，血管平滑肌细胞大量迁移至血管内膜并见泡沫细胞，病理学结果提示家兔AS 模型复制成功。

1.4.2 细胞分组及ox-LDL 诱导损伤的HUVEC细胞模型复制选生长状态良好的HUVEC 制备细胞悬液，通过计数调整上述细胞浓度到1×106mL/L，接种于培养瓶内培养24 h，观察HUVEC 生长情况。用无血清的基础培养基替换完全培养基，同化HUVECs 24 h 后作为备用细胞。将上述细胞分成9 组，即正常对照组；模型组；10 μmol/L Vit E 组、1 μmol/L 辛伐他汀组；3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 的Corilagin 药物组（终浓度）。同化后弃培养液，加入完全培养基，并分别加入相应浓度的阳性药及Corilagin，孵育24 h，除正常对照组外其余组HUVECs 细胞中加入终浓度为70 mg/L 的ox-LDL 10 μL 刺激12 h，复制损伤模型。每组设6 个平行孔，实验重复3 次。

1.4.3 Q-PCR 方法测定家兔动脉粥样硬化斑块和ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 的mRNA 表达利用蛋白酶消化液收集HUVEC 细胞；研钵中装有液氮，将各组主动脉斑块组织研磨成粉末。总RNA 提取使用Trizol 一步法。纯度检测和定量后取1 μg RNA，cDNA 的获得可采用Superscript III cDNA 合成试剂盒逆转录进行，以2 μL 的cDNA 为模板，SYBR Green II 染料法进行实时荧光定量PCR。反应体系：上下游引物（0.2 μmol/L） 各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，含2×AllinOneTM Q-PCR Mix 10 μL。Ct 值采用Rotor-Gene 6.1.0.81软件进行分析检测。5'-3'PCR 引物：TLR4 目的基因，上游CCATTTTATGTCATTTTCTT，下游GCTATCTGTGAGCGTGTATC；β-actin 内参，上游引物TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下 游 引 物GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC。各样本的内参基因和TLR4 目的基因均设3 个复孔，并计算Ct平均值。本研究基因的表达变化采用△△Ct 相对定量法进行。使用相对定量法表示目的基因TLR4的拷贝数，内参基因先进行标化，先后获得对照组、实验组的目的基因、内参基因的CT 值，△CT（1） ＝（实验组目的基因CT 值－实验组内参基因CT 值）；△CT（2） ＝（对照组目的基因CT 值－对照组参考基因CT 值）；△△CT＝△CT（1）－△CT（2）。实验组目的基因相对于内参基因的表达相对定量用2-△△CT表示，得到TLR4 基因的相对表达量。

1.4.4 Western Blot 方法测定家兔动脉粥样硬化斑块和ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 的蛋白表达 将各组血管斑块组织剪碎后放入装有液氮的冷研钵中，充分研磨，然后加入300 mL 单去污剂裂解液（含PMSF） 于冰浴中裂解提取HUVEC 总蛋白质。标准曲线以牛血清白蛋白制作，蛋白浓度采用BCA 法检测。常规电泳、转模、封闭后分别加入TLR4 一抗和β-actin 内参，于洗膜后再用二抗羊抗兔进行孵育。试剂激发荧光用Western blot 检测，显示于X 光片，显影、扫描，系统成像经数码凝胶图像定量分析、条带的灰度值经条带密度扫描检测。内参为同管β-actin，计算目的蛋白TLR4 的相对表达量（TLR4 目的基因/ 内参β-actin）。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 Corilagin 对家兔动脉粥样硬化斑块中TLR4蛋白及mRNA 表达的影响

2.1.1 Corilagin 对家兔动脉粥样硬化斑块中TLR4 mRNA 表达的影响从图2 显示，18 S 与28 S 两个条带清晰可见，28 S 亮度大约是18 S 的两倍，胶上无其它大分子条带；说明总RNA 提取完整，无大分子物质的污染，可用于后续的反转录及实时荧光定量PCR 实验。

Q-PCR 结果显示，高脂饲料喂养造模后，模型对照组胸主动脉斑块TLR4 mRNA 表达水平明显升高，与正常对照组比较P＜0.05。1、2 和4 mg/kg 剂量的Corilagin 与2.5 mg/kg 辛伐他汀均明显降低胸主动脉斑块TLR4 mRNA 的表达水平，与模型组比较，P＜0.05，见表1。

图2 总RNA 提取完整性检验Fig.2 The extraction integrity test of total RNA

表1 Corilagin 对家兔AS 斑块中TLR4 mRNA 表达的影响（）Tab.1 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

表1 Corilagin 对家兔AS 斑块中TLR4 mRNA 表达的影响（）Tab.1 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，▲P＜0.05。

2.1.2 Corilagin 对家兔动脉粥样硬化斑块中TLR4蛋白表达的影响高脂饲料喂养造模后，模型对照组斑块TLR4 蛋白表达水平明显升高，与正常对照组比较，P＜0.05。1、2 和4 mg/kg 剂量的Corilagin 与2.5 mg/kg 辛伐他汀均能明显降低斑块TLR4 蛋白的表达水平，与模型组比较，P＜0.05，见图3，表2。

图3 AS 斑块中TLR4 蛋白表达水平Fig.3 The expression level of TLR4 protein 1:正常对照组；2:2.5 mg/kg 辛伐他汀组；3～5:4、2 和1 mg/kg 的Corilagin 组；6:模型对照组。

表2 Corilagin 对家兔AS 斑块中TLR4 蛋白表达的影响（）Tab.2 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

表2 Corilagin 对家兔AS 斑块中TLR4 蛋白表达的影响（）Tab.2 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，▲P＜0.05。

2.2 Corilagin 对ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4蛋白及mRNA 表达的影响

2.2.1 Corilagin 对ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 mRNA 表达的影响Q-PCR 结果显示，用ox-LDL 培养液培养HUVEC 24 h 后，与正常对照组比较，ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 mRNA 表达上调，有明显统计学差异（P＜0.05）。与ox-LDL 损伤模型组比较，用不同浓度Corilagin（3.125-25 μmol/L） 干预HUVEC 24 h 后，随着Corilagin 浓度的升高其TLR4 的mRNA 表达量减少，与ox-LDL 损伤模型组比较有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 Corilagin 对ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 mRNA表达的影响（）Tab.3 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in ox-LDL injured HUVEC （）

表3 Corilagin 对ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 mRNA表达的影响（）Tab.3 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in ox-LDL injured HUVEC （）

与正常对照组比较，##P＜0.01；与ox-LDL 模型组比较，**P＜0.01。

2.2.2 Corilagin 对ox-LDL损伤的HUVEC 中TLR4 蛋白的影响 实验结果表明，与正常对照组比较，ox-LDL 模型组的蛋白表达明显提高（P＜0.05）；与ox-LDL 模型组比较，Corilagin 各组及阳性对照药1 μmol/L 辛伐他汀、10 μmol/L 维生素E能够明显抑制TLR4 蛋白表达（P＜0.05），且Corilagin 各组成量效关系抑制TLR4 蛋白表达（见图4和表4）。

图4 ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 蛋白表达水平Fig.4 The expression level of TLR4 protein in HUVEC injured by ox-LDL

表4 Corilagin 对ox-LDL 损伤HUVEC 中TLR4 蛋白表达的影响（灰度值） （）Tab.4 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in HUVEC injured by ox-LDL（）

表4 Corilagin 对ox-LDL 损伤HUVEC 中TLR4 蛋白表达的影响（灰度值） （）Tab.4 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in HUVEC injured by ox-LDL（）

与正常对照组比较，#P ＜0.01；与模型对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

3 讨论

心血管疾病是全世界最常见的死亡原因，到2030 年，死亡人数预计将达到3 000 万。AS 是心血管疾病的主要病因之一，全球每年约有2 000 万人死于AS[9]。目前，随着调血脂、抗血小板和他汀类等药物的使用，AS 病死率有所下降，但存在一定的不良反应，预后不理想。因此，寻找和开发新的疗效明确、不良反应较小的天然药物具有重要意义。有研究表明，Corilagin 具有广泛的临床应用价值，例如，具有抗肿瘤、肝保护、抗炎等作用[10]。本课题组前期研究也发现了Corilagin 可影响HUVEC 和VSMC 的增殖和下调LOX-1 蛋白及mRNA 的表达，起到良好的抗AS 作用。然而Corilagin 对TLR4 基因的调控作用尚未有研究报道。因此，在本研究中，笔者探索了Corilagin 对AS 斑块及ox-LDL 受损的HUVEC 中TLR4 蛋白和mRNA 表达影响，进一步探索Corilagin 对AS 的作用机制，为深入研究抗AS 新型药物提供科学的理论和实验依据。

TLR4 是一种炎症因子，处于全身炎症瀑布效应的中间环节，主要通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88） 依赖型与非MyD88 依赖型通路参与炎性反应。在MyD88 依赖通路中，TLR4 主要通过激活转录因子NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶MAPKs 导致炎性因子的产生和释放[11]。该联级反应中涉及到很多关键因子，例如，丝/ 苏氨酸白细胞介素-1 受体激酶I-RAKs、肿瘤坏死因子受体活化因子 6（TRAF-6）。在非MyD88 依赖型通路中，TLR4 可通过激活干扰素调节因子3（IRF3） 和NF-κB 来释放INF-1 和各种炎症因子的产生和释放[12]。有研究表明，在脓毒血症小鼠模型上，Corilagin 可下调TLR4 表达抑制MyD88 依赖通路，从而减少炎症反应[2]。Yonekawa 等[13]提出TLR4 在破裂斑块中的含量远高于外周血。有研究团队也在AS 病变动脉平滑肌细胞上也检测到TLR4 高表达[14]。除此之外，Katsargyris 和Michelsen 等[12]研究人员发现未使用他汀类药物的患者TLR4 的表达水平明显高于使用者，TLR4 基因缺陷的小鼠粥样斑块的形成比正常小鼠要小得多。同样的，在本实验中，我们发现高脂饲料喂养的模型对照组中TLR4 蛋白及mRNA的表达显著高于正常对照组。ox-LDL 是影响动脉粥样硬化发生发展的重要因素之一，具有细胞毒性作用，可通过氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1） 上调血管转录基因，激活核转录因子诱导多种炎症因子和黏附分子的表达，从而损伤血管内皮细胞、促进平滑肌细胞增生，使局部内膜出现粥样斑块[15]。本实验表明，Corilagin 能明显抑制ox-LDL 损伤的HUVEC 中TLR4 蛋白和mRNA的表达（表3-6；图3-6）。因此，Corilagin 对抗动脉粥样硬化的发生发展与下调TLR4 表达量密切相关，但具体通过哪条通路影响TLR4 的表达尚需进一步探索。