海鞘桔青霉Asc2-4培养基和溶氧条件优化对产油性能的影响

罗正东，高 平，雷晓凌，刘焕明，钟 敏

海鞘桔青霉Asc2-4培养基和溶氧条件优化对产油性能的影响

罗正东1，高 平2，雷晓凌1，刘焕明1，钟 敏1

（1. 广东海洋大学食品科技学院 // 广东省水产品加工与安全重点实验室 // 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；2. 国家海产品质量监督检验中心(湛江)，广东 湛江 524088）

【】优化海鞘（）桔青霉（）Asc2-4培养基和溶氧条件，以提高其生物量和产油率。采用单因素法优化培养基碳氮源及碳氮源比，通过正交试验优化无机盐，采用组合法优化溶氧条件，通过干质量法、酸热提油法及气相色谱法评价优化结果。经培养基优化，确定碳源为葡萄糖，葡萄糖质量浓度为100 g/L，氮源种类为蛋白胨+酵母膏（1∶1），碳氮比为100，无机盐配比为KH2PO44 g/L、MgSO4150 mg/L、FeCl330.0 μg/L；溶氧组合优化条件为转速220 r/min，250 mL锥形瓶装液量100 mL。最终生物量和油脂质量浓度分别提高至19.90、8.76 g/L，比未优化前约提高1.5倍和20倍；发酵油的不饱和脂肪酸质量分数达53.37%，其中油酸和亚油酸皆达到26%以上。优化后菌株的产油性能大幅提高，该菌有作为生产油酸和亚油酸的工业菌种潜力。

桔青霉；海鞘；产油性能；培养基优化；溶氧条件优化

微生物油脂是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物利用外源营养物质合成并储存在细胞内的油脂[1]。海洋相较于陆地具有高盐、高压和低氧的极端特点，因此，海洋真菌具有独特的产油性质[2]。海鞘 () 为脊索动物门，尾索亚门，海鞘纲动物。柴慧子等[3]在雷州海鞘中筛选出一株产油桔青霉（）Asc2-4，其不饱和脂肪达到65.00%，具有开发微生物功能性油脂的潜力。迄今，将海鞘共附生微生物开发为油脂工业菌的发酵研究鲜有报道。

产油真菌一般可利用多种碳源生长，积累油脂。研究发现，产油真菌的适宜碳源一般为甘油和葡萄糖[4]。碳源的浓度可影响产油真菌的油脂含量和不饱和组分，裂殖壶菌（sp. S31）在25 g/L的低葡萄糖质量浓度条件下可促进生成DHA，而100 g/L高葡萄糖质量浓度下可提高脂质含量[5]。不同产油真菌的适宜氮源种类不同，马治灿[6]发现，产油镰刀霉（sp.WHJ13）的最适单一氮源为硝酸钾。碳氮比过高不利于生物量的提高，碳氮比过低易使发酵时间延长[7]。金属离子可影响产油微生物胞内外渗透压和酶活力，从而影响产油微生物的油脂合成能力[8]。薛汉明等[9]发现，Fe3+对三角褐指藻（Bohlin）的去不饱和酶活性有促进作用。有研究表明，低浓度的Mg2+对单针藻（sp. FXY-10）生物量和油脂浓度均有促进作用[10]。转速及装液量决定培养基的溶氧条件，影响菌体生长和产油量。钟琦等[11]发现，转速120 r/min和每瓶 (250 mL) 空气量70 mL的条件可促进油脂酵母（HL）的生物量增长，对油脂产量影响程度较小。目前，针对提高真菌产油的研究主要在培养基成分及发酵条件。本研究通过优化培养基及溶氧条件，提高桔青霉Asc2-4的生物量和油脂浓度，为该菌规模化生产功能性油脂研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培养基 菌株：桔青霉（）Asc2-4分离自广东省雷州市流沙虾塘的海鞘（），保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号GDMCC 60059。

种子培养基（g/L）：马铃薯浸出粉8，葡萄糖20，海精盐15，硫酸铵10。

初始发酵培养基（g/L）：葡萄糖120，马铃薯200（去皮，切碎，加蒸馏水煮沸15 min，滤渣），柠檬酸钠0.1，磷酸氢二钾0.2，磷酸二氢钾2.0，酵母膏0.5，硫酸铵2，海精盐15。发酵前后pH在5.7 ~ 5.8之间。

1.1.2 主要仪器与设备 HZQ-F160振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；BMJ-25型霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；GC-2010PLUS气相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 种子培养与发酵 种子培养：挑取一环孢子接种于装有200 mL种子培养基的500 mL锥形瓶，在摇床中以28 ℃、180 r/min的条件培养2 d。

摇床发酵培养：将培养后的种子液按体积分数5%接种于含200 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在摇床中以28 ℃、140 r/min条件发酵7 d。

1.2.2 碳氮源单因素优化 碳源优化实验：葡萄糖、麦芽糖、甘油、乳糖和蔗糖。碳源浓度优化实验：葡萄糖质量浓度设为50、75、100、125、150 g/L。氮源优化实验：蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素和牛肉膏，按质量比1∶1的比例添加酵母膏。碳氮源比优化实验：碳源（葡萄糖）浓度固定的前提下，添加不同浓度优化后的氮源，使碳、氮源质量比分别为40、60、80、100、120。

1.2.3 无机盐正交优化 通过预实验，从8种无机盐KH2PO4、NaH2PO4、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、FeCl3、ZnSO4和CoCl2中筛选3种明显提高产油量的无机盐KH2PO4、MgSO4和FeCl3，并以产油量为指标，设计3因素3水平（表1）正交试验L9（33）。

表1 正交试验的因素水平

1.2.4 溶氧条件组合优化 将摇床转速140、180、220、260 r/min分别与250 mL锥形瓶装液量100、150、200 mL设置成12组不同溶氧条件，通过优化，确定最佳的转速及装液量。

1.2.5 评价指标 1）生物量测定。生物量采用细胞干质量法[12]测定，将菌丝置于109 ℃的烘箱中烘干，称取质量。

生物量计算：干菌生物量（g/L）=（带干菌体培养皿质量‒ 培养皿质量）/ 发酵培养皿体积

2）油脂浓度。采用酸热法[13]提取油脂：按每1.00 g的干菌体添加4.00 mol/L的盐酸6.00 mL，置室温下30 min，沸水浴加热10 min，‒20 ℃下速冻，反复2至3次，加入2倍体积的氯仿-甲醇（体积比2∶1），振荡，以2 000 r/min离心15 min，挥发有机相即得油脂。

油脂质量浓度（g/L）= 总油脂质量/ 发酵培养基体积。

3）脂肪酸组分。样品甲酯化[14]，使用气相色谱仪分析脂肪酸组分。

气相色谱条件：SP-2560气相毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.2µm）；检测器为氢火焰离子检测器（FID）；进样口温度225℃；检测器温度250℃；分流比10∶1。程序升温条件：柱温100 ℃，维持13 min；以10 ℃/min升至180 ℃，维持6 min；再以1 ℃/min升至200 ℃，维持20 min；再以4 ℃/min升至235 ℃，维持20 min。

1.2.6 数据处理 采用软件SPSS 22.0对数据进行单因素分析（ANOVA）和Duncan多重比较，判断组间显著性差异，= 0.05。

2 结果与分析

2.1 碳氮源及碳氮源比单因素优化

2.1.1 碳源优化 由图1可知，桔青霉Asc2-4可利用此5种碳源合成油脂。蔗糖、麦芽糖和甘油的生物量相近，分别为5.65、5.00、5.78 g/L，油脂质量浓度亦相近，分别为0.32、0.35、0.25 g/L，该菌对3种碳源的利用能力相近。桔青霉Asc2-4对乳糖的利用效率最低。葡萄糖作为碳源时生物量最高（< 0.05），达7.35 g/L，油脂质量浓度为0.40 g/L。因此，葡萄糖可提高显著该菌生物量（< 0.05），而5种碳源对油脂质量浓度影响不显著（> 0.05），确定葡萄糖为最适碳源。

同一指标凡含一个相同字母则差异无统计学意义（P> 0.05）

2.1.2 碳源浓度优化 图2表明，桔青霉Asc2-4生物量随葡萄糖质量浓度的增加呈先升后降变化趋势，100、150 g/L时生物量最高（< 0.05）；而油脂质量浓度呈降低趋势，150 g/L时最低（< 0.05）。在葡萄糖质量浓度为150 g/L时，生物量和油脂浓度出现下降可能是因为葡萄糖浓度过高，菌体生长与油脂积累出现抑制[15]。葡萄糖为100 g/L时的生物量和油脂质量浓度平均值均最高（分别为8.33 g/L和0.56 g/L），为最适浓度。

同一指标凡含一个相同字母则差异无统计学意义（P> 0.05）

2.1.3 氮源优化 图3表明，对于无机氮源而言，硫酸铵比硝酸钾更利于菌体生长和积累油脂，可知该菌对氨基氮源利用效率比硝基氮源高。对于有机氮源为蛋白胨时，桔青霉Asc2-4的生物量和油脂浓度均最高，平均值分别为8.78、2.71 g/L，蛋白胨相较于其他氮源对于提高油脂浓度效果最为显著（< 0.05），因此，桔青霉Asc2-4的最适氮源为蛋白胨（图3）。对比氮源硫酸铵和蛋白胨，该菌的生物量相近（> 0.05），而前者油脂浓度降低，平均值分别为0.46 g/L和0.75 g/L，可见，蛋白胨更利于该菌积累油脂，可能与蛋白胨所含刺激产油的必需营养物质有关[16]。

同一指标凡含一个相同字母则差异无统计学意义（P> 0.05）

2.1.4 碳氮源比的优化 图4表明，碳氮源比在40 ~ 80的范围内，生物量平均值呈下降趋势，而油脂浓度平均值逐渐升高，可能是因为氮源减少，菌体生长受抑制，菌体因氮源含量逐渐降低而进入油脂积累阶段，从而提高油脂积累量[17]。碳氮源比为100时，油脂浓度最高，平均值达到2.71 g/L，生物量平均值为11.59 g/L（图4），表明该菌在高碳氮比的条件下更有利于油脂合成。碳氮源比为120时生物量及油脂浓度均显著下降，可能是因为氮源不足限制了菌丝生长，从而油脂合成受到抑制[18]。

同一指标凡含一个相同字母则差异无统计学意义（P> 0.05）

2.2 无机盐正交优化

正交试验极差分析结果如表2所示。

表2 无机盐正交试验结果

表2可见，KH2PO4、MgSO4和FeCl3三种无机盐的数据均值最高水平分别为A2、B3、C1，所以无机盐添加量的最佳浓度为A2B3C1，即KH2PO44.0 g/L、MgSO4150.0 mg/L、FeCl330.0 μg/L，且影响因素A＞C＞B，KH2PO4对菌株发酵产油脂的影响最大，MgSO4和FeCl3在影响油脂浓度方面存在较大的交互作用。经无机盐优化后油脂浓度达到4.73 g/L，提高42%。

2.3 溶氧条件组合优化

由图5A可知，180 r/min的转速条件最有利于菌体生长，在转速180 r/min、250 mL锥形瓶装液量（下称“装液量”）100 mL，转速180 r/min、装液量150 mL的条件下，该菌的生物量较高，平均值分别达到20.39、20.62 g/L。而在260 r/min的高转速条件下，生物量在11.79 ~ 17.44 g/L之间，仍然较高，表明该菌具有较高的抗液态剪切力能力，该特性对工业产油具有重要意义[19]。如图5B所示，该菌在转速140 ~ 260 r/min的范围内，油脂浓度呈现先升高后下降，220 r/min为适宜油脂积累的转速条件。其中，转速220 r/min、装液量100 mL的溶氧条件下最利于产脂，油脂质量浓度达到最高，为8.76 g/L。因此，确定转速220 r/min及装液量100 mL为最适产油的溶氧条件。

装液量指250 mL锥形瓶中的装液量；同装液量凡含一个相同字母则差异无统计学意义（P> 0.05）

2.4 优化条件后桔青霉Asc2-4的油脂脂肪酸组分

由表3可知，优化条件后桔青霉Asc2-4油脂主要为C16和C18系脂肪酸，含量最高的四种脂肪酸依次为亚油酸（C18:2）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、棕榈酸（C16:0），其中功能价值较高的脂肪酸为油酸和亚油酸，质量分数分别为26.05%和26.67%，该两种脂肪酸的质量分数达52.72%。桔青霉Asc2-4所产油脂脂肪酸组分与Kyle等[20]研究的油脂酵母（）相似，但是桔青霉Asc2-4的亚油酸质量分数约高23%。综上可知，桔青霉Asc2-4可用于生产功能性油脂油酸和亚油酸。

表3 优化条件后桔青霉Asc2-4油脂的脂肪酸组成

说明：1）在总脂肪酸中的比例。

Note: 1) Percentage of fatty acid to total fatty acid.

3 结论

桔青霉Asc2-4最佳培养基配方为葡萄糖100 g/L、蛋白胨0.5 g/L、酵母膏0.5 g/L、KH2PO44 g/L、MgSO4150 mg/L、FeCl330.0 μg/L；最佳溶氧条件为转速220 r/min、250 mL锥形瓶装液量100 mL。优化后生物量和油脂质量浓度分别达19.90 g/L和8.76 g/L，分别比未优化前约提高1.5倍和20倍。不饱和脂肪酸占总脂肪酸的53.37%，油酸和亚油酸的质量分数分别为26.05%和26.67%。桔青霉Asc2-4有作为产功能性油脂的工业生产菌株潜力，有开发研究的价值。

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Optimization of Culture Medium and Dissolved Oxygen for Improving Oil-producing Properties ofAsc2-4 from

LUO Zheng-dong1, GAO Ping2, LEI Xiao-ling1, LIU Huan-min1, ZHONG Min1

（1.////,524088,; 2.N(),524088,）

To improve the biomass and oil yield ofAsc2-4 fromby optimizing the culture medium and dissolved oxygen and to provide the basis for industrial production.The carbon and nitrogen sources and the ratio of C source to N source (C/N) in the medium were optimized by a single factor, the inorganic salts by orthogonal method, and the dissolved oxygen by combination method. The optimization results were evaluated by dry weight method, acid-hot oil extraction method and gas chromatography.The optimal medium consist of a carbon source that was glucose with the concentration of 100 g/L, a nitrogen source with peptone+yeast extract (1∶1), a C/N of 100, inorganic salt content of KH2PO44 g/L, MgSO4150 mg/L, FeCl32.0 μg/L. The optimal combination conditions of dissolved oxygen were determined that the rotation speed was 220 r/min, loading volume was 100 mL in 250 mL conical flask. Finally, biomass and oil mass concentration were increased to 19.90 g/L and 8.76 g/L respectively, which were 1.5 times and 20 times higher than unoptimized control. The content of unsaturated fatty acid in the fermented oil was 53.4%, among which oleic acid and linoleic acid was over 26%.The optimization of medium and dissolved oxygen can greatly improve oil-producing properties of the strain, which has the potential to be used as an industrial strain for producing oleic acid and linoleic acid.

;; oil-producing properties; medium optimization;dissolved oxygen optimization

Q949.32

A

1673-9159（2020）06-0102-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.013

罗正东，高平，雷晓凌，等. 海鞘桔青霉Asc2-4培养基和溶氧条件优化对产油性能的影响[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（6）：102-107.

2019-11-14

湛江市科技计划项目（2016A02020）

罗正东（1993—），男，硕士研究生，研究方向为海洋真菌资源研究。E-mail: 794008688@qq.com

雷晓凌（1963—），女，硕士生导师，研究方向为海洋真菌及活性物质研究。E-mail: 1252765610@qq.com

（责任编辑：刘庆颖）