表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒的构建与筛选

张克龙，郝鹏飞，巫介棚，朱羿龙，许 汪，韩继成，哈 卓，杜寿文，花群义，曹琛福，郑 敏，罗廷荣，金宁一，李 昌

(1. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004；2. 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所省部共建吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122；3. 深圳海关动植物检验检疫中心，广东 深圳 518045；4. 广西壮族自治区动物疫病防治中心，广西 南宁 530001)

蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)是呼肠孤病毒科环状病毒属成员。其传播主要借助节肢动物如库蠓、沙蝇等[1]。蓝舌病是世界动物卫生组织(OIE)规定必报的动物传染性疫病，我国也将其列为一类动物疫病。蓝舌病的重大危害主要体现在：对绵羊和山羊的致死率高，导致严重的经济损失，人力物力消耗巨大。至2019年，BTV已有27种血清型，中国至少有7种BTV血清型，但主要流行血清型为BTV-1型和16型[2]。本实验室已经应用痘苗病毒载体成功构建和表达了许多病毒抗原基因，如HIV[3]等，已验证痘苗病毒载体的稳定性与安全性。蓝舌病病毒VP2作为蓝舌病病毒衣壳蛋白，在病毒吸附过程中发挥重要作用，是决定血清型的特异性抗原。该抗原能刺激机体产生特异性中和抗体以保护动物，是蓝舌病新型基因工程疫苗研究的首选抗原。

痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tian Tan,VTT)可以有效刺激机体的固有免疫和适应性免疫应答，常常用作疫苗的表达载体。本实验室前期设计了一种痘苗病毒穿梭载体(pSTKE)，可以携带外源基因插入至痘苗病毒的胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)基因处，使该基因失活。TK基因不是痘苗病毒复制的必须基因，但TK基因的缺失会减弱痘苗病毒的复制能力，使痘苗病毒适用于作为疫苗递送载体。

目前商用疫苗包括减毒疫苗和灭活苗，国内外尚无使用痘苗病毒载体进行蓝舌病16型重组疫苗的研究，因此本研究拟利用本实验室构建的痘苗病毒载体pSTKE，构建出1株能够稳定表达16型BTV VP2蛋白并且具备良好的免疫原性和安全性的重组痘苗病毒疫苗(rVTT-VP2)，以期为防控16型蓝舌病提供安全有效的疫苗。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、病毒和细胞株 含有BTV-16VP2基因的质粒由深圳海关动植物检验检疫中心花群义研究员惠赠。感受态Trans-T1和载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，均购自北京全式金生物技术有限公司。痘苗病毒穿梭载体pSTKE、痘苗病毒天坛株(VTT株)和BHK-21细胞由本实验室保存。

1.2 试剂 限制性核酸内切酶XbaI、SalI，Lipofectamine 3000转染试剂，均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素，均购自Gibco公司；质粒小量制备试剂盒，购自Axygen公司；2×TaqPCR预混试剂，购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 目标基因引物设计及穿梭质粒的构建 为构建痘苗病毒穿梭质粒，利用NCBI设计BTV-16VP2引物，上游添加酶切位点XbaⅠ及Kozak序列，下游添加酶切位点SalⅠ。引物序列为BTV-16VP2-F：5′-ATCTAGAGCCACCATGGCTGCTCAGAA-3′；BTV-16VP2-R：5′-GTCGACTTTTGCTAGCCTACACAGTCGGCGCA-3′；TK-F：5′-GGACGCGTATTGATTCACACCGTATTACAG-3′；TK-R：5′-CGCCCGGGTTCTCCTAATAAGTTACACCGT-TTG-3′。以含有BTV-16VP2的质粒为模板，扩增出目的片段，将其连接至载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector并转化到感受态Trans-T1，挑取单克隆菌落，小量提取质粒，得到pEASY-VP2。使用核酸内切酶XbaⅠ、SalⅠ 37 ℃双酶切质粒pEasy-VP2，将VP2连接到经过同样酶切的pSTKE中，转化到Trans-T1，挑取单克隆菌落和小量提取质粒后得到pSTKE-VP2。

1.4 痘苗病毒的重组、筛选及纯化 于6孔板中每孔接种2×106个BHK细胞，感染5 MOI 的VTT，37 ℃、5% CO2感染2 h，再用pSTKE-VP2质粒转染至感染了VTT的BHK细胞。48 h后收获细胞，反复冻融3次，低速离心后获取上清，得到rVTT-VP2。

将上述上清接入BHK-21细胞，48 h后挑取绿色荧光噬斑，反复冻融后再次接入BHK细胞，重复以上操作，直至噬斑处均为绿色荧光病变细胞，获得高纯度的rVTT-VP2。

1.5 重组痘苗病毒的PCR和RT-PCR鉴定 扩增rVTT-VP2病毒，48 h后收取病变细胞，并提取基因组DNA和RNA。用1.2引物，扩增VP2和痘苗非必须TK基因。

1.6 重组痘苗病毒遗传稳定性分析 将rVTT-VP2在BHK-21细胞中连续传代20次，取1、5、10、15、20代病变细胞，并提取基因组DNA，用PCR方法检测rVTT-VP2的遗传稳定性。

2 结果

2.1 穿梭质粒的构建、鉴定 利用1.2所示引物BTV-16VP2-F和BTV-16VP2-R，以含有BTVVP2基因的质粒为模板进行PCR扩增可成功获得2 706 bp的片段(图略)，送吉林省库美生物科技有限公司进行测序，目的基因与理论序列一致。

使用XbaⅠ、SalⅠ双酶切pSTKE-VP2可成功切出2 706 bp的目的片段和4 527 bp的载体片段，如图1，与预期结果一致，证明穿梭质粒pSTKE-VP2构建成功。

图1 穿梭质粒pSTKE-VP2酶切鉴定Fig.1 Digestion identification of shuttle plasmid pSTKE-VP2M:λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker; 1:质粒pSTKE-VP2 XbaⅠ/SalⅠ; 2:质粒 pSTKE-VP2M：λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker； 1：Plasmid pSTKE-VP2 XbaⅠ/SalⅠ； 2：Plasmid pSTKE-VP2

2.2 痘苗病毒的重组、筛选及纯化 将pSTKE-VP2转染至感染了VTT的BHK-21细胞后，用噬斑纯化法筛选重组病毒rVTT-VP2，直至噬斑处均为绿色荧光病变细胞(见中插彩版图2)。

图2 重组痘苗病毒的筛选 (200×)Fig.2 Screening of recombinant vaccinia virus (200×)A、B：空白对照； C、D：共转染； E、F：第1代重组痘苗病毒筛选； G、H：第5代重组痘苗病毒筛选； I、J：第10代重组痘苗病毒筛选A、B：Mock； C、D：Co-transfection； E、F：Screening of 1st recombinant vaccinia virus； G、H：Screening of 5th recombinant vaccinia virus； I、J：Screening of 10th recombinant vaccinia virus

2.3 重组痘苗病毒PCR和RT-PCR鉴定 提取筛选成功的重组病毒rVTT-VP2的基因组DNA和RNA，使用1.2引物分别扩增BTV-VP2基因、TK基因，进行基因组整合与转录的鉴定。结果如图3所示，重组痘苗病毒基因组DNA和cDNA扩增出BTV-16VP2片段，未扩增出VTTTK基因特异性条带，证明已成功筛选出rVTT-VP2。

图3 重组痘苗病毒的PCR和RT-PCR鉴定Fig.3 Identification of recombinant vaccinia virus by PCR and RT-PCRM：λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker； 1：rVTT-VP2 gDNA； 2：rVTT-VP2 cDNA； 3、4：阴性对照；5：VTT TK； 6：TK阳性对照； 7：rVTT-VP2 gDNA；8：rVTT-VP2 cDNAM：λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker； 1：rVTT-VP2 gDNA；2：rVTT-VP2 cDNA； 3、4：Negative control； 5：VTT TK；6：TK positive control； 7：rVTT-VP2 gDNA；8：rVTT-VP2 cDNA

2.4 遗传稳定性分析 将筛选成功的rVTT-VP2连续传20代，利用1.2的引物扩增其基因组，对其结构稳定性进行检测，结果如图4所示，1、5、10、15、20重组痘苗病毒rVTT-VP2均能扩增出2 706 bp的目的片段，表明重组痘苗病毒rVTT-VP2传代20次内具有良好的遗传稳定性。

图4 重组痘苗病毒rVTT-VP2遗传稳定性Fig.4 Genetic stability of recombinant vaccinia virus rVTT-VP2M：Wide range DNA Marker； 1～5:rVTT-VP2第1代、第5代、第10代、第15代、第20代； 6：阴性对照； 7：阳性对照M:Wide range DNA Marker; 1～5:1st,5th,10th,15th,20th generation of rVTT-VP2; 6:Negative control; 7:Positive control

3 讨论

蓝舌病病毒有27个血清型，众多血清型缺乏交叉保护[4]。BTVL2基因编码的VP2是BTV的主要衣壳蛋白，位于无囊膜BTV的最外层，在病毒吸附和侵入宿主细胞的过程中起到重要作用。其诱导机体产生特异性血清型抗体，中和蓝舌病病毒。VP2的失活将导致蓝舌病病毒失去血凝活性[5]。就目前而言，国内疫苗的研究进展主要在以下几个方面：蓝舌病1型灭活苗[6]、禽痘病毒载体疫苗、马疱疹病毒载体、VLP、蓝舌病16型腺病毒载体表达等；蓝舌病3、4、5、8、15、12、16、25型单抗的制备[7-9]。但尚没有进行16型痘苗病毒重组蓝舌病疫苗的研究。

痘苗病毒载体是当前应用比较广泛的新型疫苗载体，痘苗病毒宿主范围广，研究背景较为清楚，安全高效，基因组庞大，插入较为巨大的外源基因片段的同时仍然具有感染的能力。为此，我们进行了表达16型蓝舌病病毒VP2基因的重组痘苗病毒的构建。构建时，在VP2基因前添加了Kozak序列，以增强目的基因的表达；而且突变了VP2基因中3个痘苗病毒终止信号序列(TTTTNT)可免受其他外源基因转录的干扰。PCR组病毒从基因水平进行鉴定及遗传稳定性分析。结果表明，本研究构建的rVTT-VP2遗传稳定性良好，能稳定表达蓝舌病衣壳蛋白VP2，rVTT-VP2可在BHK-21细胞上大量稳定表达，为后续免疫动物实验奠定了坚实基础。