伪狂犬活疫苗C株抗体消长规律及攻毒保护试验

马晶晶，高俊锋，吴碧清，韩相敏，张 江，赖 志

(1. 上海创宏生物科技有限公司，上海 松江 201619；2. 上海农林职业技术学院，上海 松江 201699)

猪伪狂犬病(Pseudorahies，PR)是由疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies vires，PRV)引起的多种家畜和野生动物的以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。猪是本病的原发感染宿主，又是病毒的长期储存和排毒者[1-2]。母猪主要造成繁殖障碍，仔猪主要表现为神经症状、呼吸困难、拉稀等临床症状。2011年后，我国多地区出现猪伪狂犬变异株并流行，引发猪只死亡，经济损失严重。

疫苗接种是防治猪伪狂犬病的重要手段之一。目前猪伪狂犬病常规疫苗在接种后虽然能预防临床症状的出现，但不能防止强毒在被感染动物体内复制、排出。有报道表明，新型自然弱毒株疫苗的应用可控制猪伪狂犬病的潜伏感染[3-5]。

伪狂犬活疫苗C株疫苗毒株，自然缺失基因片段gI、gE、Us9、Us2，本试验拟通过中和抗体和攻毒保护试验对伪狂犬活疫苗C株的免疫原性进行研究，并通过与常规疫苗Bartha株进行比较，评估其作为疫苗的应用，并为其在生产上推广应用提供理论依据，以加速伪狂犬病基因缺失疫苗在我国用于防治和根除伪狂犬病的进程[6-8]。

1 材料与方法

1.1 强毒株 伪狂犬病病毒HB-11株，新流行野毒株，由上海创宏生物科技有限公司提供。

1.2 试验用疫苗 猪伪狂犬活疫苗C株，购自武汉中博生物股份有限公司。

1.3 伪狂犬Bartha株疫苗 购自西班牙海博莱生物大药厂。

1.4 细胞系 非洲绿猴肾传代细胞，由上海创宏生物科技有限公司提供。

1.5 参照抗原和阳性血清 试验用抗原为伪狂犬病病毒细胞培养物,中和抗体效价为1∶256；阳性血清为猪伪狂犬病病毒感染血清，中和抗体效价为1∶256。参照抗原和阳性血清均由上海创宏生物科技有限公司制备和保存。

1.6 试验动物 断奶仔猪，40头，4周龄。所有动物在试验前均经乳胶凝集试验检测为伪狂犬病病毒血清学阴性。试验在严格隔离条件下进行。由上海交通大学七宝校区试验猪场提供。

1.7 方法

1.7.1 抗体消长曲线的测定 将伪狂犬抗体阴性的健康断奶仔猪20头，随机分成A、B两组，每组10头。A组：免疫组，颈部肌肉注射猪伪狂犬活疫苗C株1 mL，接种剂量为106.5TCID50；B组：对照组，颈部肌肉注射DMEM培养基1 mL。分别在接种前1天(记为D1)、接种后第3天(记为D3)、第7天(记为D7)、第14天(记为D14)、第21天(记为D21)、第28天(记为D28)、第42天(记为D42)、第60天(记为D60)、第90天(记为D90)、第180天(记为D180)对每头猪进行采血，分离血清。然后使用固定病毒稀释血清方法测定中和抗体效价。

1.7.2 攻毒保护试验 将伪狂犬抗体阴性的健康断奶仔猪20头，随机分成C、D、E、F四组，每组5头。C组：C株免疫组，颈部肌肉注射猪伪狂犬活疫苗C株1 mL，接种剂量为106.5TCID50；D组:Bartha株免疫组，颈部肌肉注射伪狂犬病毒Bartha株活疫苗1 mL， 接种剂量为106.5TCID50；E组：攻毒对照组，颈部肌肉注射DMEM培养基1 mL；F组：空白对照组。在接种后第21天，C、D、E组每头猪颈部肌肉注射伪狂犬病毒HB-11株病毒液1 mL，病毒含量为106.5TCID50。攻毒后，在第1、3、5、7、14天测量试验猪体温，每天1次，详细记录体温变化；此外，每天观察各组猪群是否出现体温升高、食欲废绝、呼吸困难、神经症状、拉稀和呕吐等临床症状，统计临床症状数据，观察至攻毒后第21天；每组随机选取2只剖检，观察脑部、肺部、扁桃体、肝脏、脾脏、肾脏等病理变化[9]。分别在D1、D3、D7、D14、D21、D28、D42、D60、D90、D180对存活猪进行采血，分离血清，使用实时荧光定量PCR方法对病毒含量进行检测。

1.7.3 数据处理 数据用Excel软件进行处理后，采用SPSS 22统计分析软件对数据进行One-Way ANOVA分析及LSD法多重比较。

2 结果

2.1 抗体消长规律试验 免疫接种伪狂犬活疫苗C株后，持续检测6个月的抗体水平，结果表明，伪狂犬活疫苗C株免疫后在D7可以检测到中和抗体，并且抗体水平不断上升，D42达到抗体水平高峰，D180抗体水平仍高于20，对照组(B组)抗体检测结果一直为阴性，结果见图1。

图1 C株病毒免疫猪群后免疫组与对照组中和抗体消长规律图Fig.1 The growth and loss of neutralizing antibody with strain C between the immunized group and the control group

2.2 攻毒试验

2.2.1 攻毒后体温测定 攻毒对照组(E组)在D3和D5的体温超过40.5 ℃，Bartha株免疫组(D组)在D3的体温超过40.5 ℃，C株免疫组(C组)体温数据均低于40 ℃。方差分析结果显示，各测温时间点C组与E组均存在显著差异(P<0.05)，结果见表1。

表1 攻毒后体温Table 1 Temperature after challenge

2.2.2 攻毒后临床症状的观察 D组和E组出现发热、厌食和呼吸困难等症状；E组发病率100%(5/5)，表现为发烧、精神沉郁、呼吸困难，严重的仔猪出现神经症状，其中2头猪分别在第3天和第4天死亡。C组80%(4/5)以上仔猪表现为精神、呼吸、采食均正常，保护率不低于80%；F组仔猪均表现正常。

3.2.3 剖检病变 C组和F组剖检无明显病变；D组剖检有病变；E组剖检病变明显：脑膜充血出血，扁桃体出血，肺脏出现白色坏死灶，肝脏、脾脏颗粒状出血点明显。见中插彩版图2。

图2 攻毒对照组剖检病变Fig.2 Lesions in the challenge control group

3.2.4 病毒血症 C组较D组病毒血症持续时间短，病毒载量低，F组未检出病毒。见表2。

表2 病毒载量检测结果Table 2 Viral load detection results

4 讨论

猪伪狂犬病对养猪业的危害巨大，引起的经济损失也难以估量，这也是目前很多国家将其作为净化对象的重要原因。在我国，一直以来均依赖疫苗免疫进行防控。所以对于猪伪狂犬病病毒和相关疫苗的分析研究至关重要[10-12]。

固定病毒稀释血清方法是检测猪伪狂犬病病毒抗体的可靠方法，目前许多国家将其列为法定的检测方法。猪伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科，中和抗体效价不高，在其判定上，有不少学者以血清1∶2的稀释度是否出现细胞病变作为标准，同时也有许多学者认为，动物体的中和抗体效价小于1∶2时，也不能说明动物就一定是阴性，没有感染猪伪狂犬病病毒。此外，猪伪狂犬病的免疫机理也很复杂，既有体液免疫，又有细胞免疫的参与。有的学者通过试验得出：某些动物经注射疫苗后，中和抗体水平没有转阳，但通过攻毒试验发现同样具有保护性。该病毒的这些特性，给猪伪狂犬病的临床诊断和疫苗效果的判断标准带来了复杂性。目前，一般将疫苗效果的界限定为：中和效价≥1∶2或中和抗体指数≥102.5时为血清抗体阳性[13]。

本试验对试验猪的抗体水平进行了检测，伪狂犬活疫苗C株免疫组在第7天就产生了中和抗体，并持续升高，在42 d达到高峰，在180 d中和抗体水平仍高于保护值，表明伪狂犬活疫苗C株免疫保护期可持续6个月。

攻毒保护试验中，攻毒对照组发病率100%，表现为发烧、精神沉郁、呼吸困难，严重的仔猪出现神经症状和死亡；空白对照组仔猪均表现正常；C株免疫组80%以上仔猪表现为精神、呼吸、采食均正常，保护率不低于80%。在对免疫接种猪剖检时发现，接种猪伪狂犬活疫苗C株试验组的内脏无明显病理变化，而Bartha株试验组和攻毒对照组的内脏都出现不同程度的出血和病变，且病毒血症伪狂犬活疫苗C株较Bartha株持续时间短，病毒含量低。