商品肉鸡梭菌性肠炎的试验诊断

张 寒,孔垂民,刘宗柱,刘文华

(青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是动物肠道中的常在菌[1]，当受到应激因素影响或肠道微生物区系紊乱时，便会大量繁殖引起肠道鼓气症状，并产生毒素作用于肠黏膜上皮细胞从而引起肠黏膜脱落，通常被认为是引起坏死性肠炎的主要病原菌[2-6]。随着饲料中药物添加剂的禁用，肉鸡的坏死性肠炎愈加普遍，每年给全球家禽养殖业造成的损失超过了60亿美元[7]。所以加强对该病的研究具有重要的经济意义。本试验对规模化肉鸡养殖场送检的临床肠炎症状的肉鸡肠道样品进行了产气荚膜梭菌的分离鉴定、药敏试验及同源性分析，为肉鸡梭菌性肠炎的深入认识及预防控制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 山东部分地区肉鸡养殖场送检的临床症状为腹泻、拉肉样便或过料的日龄不等肉鸡的肠道样品53份。

1.1.2 实验动物 成年昆明系小鼠，购自青岛大任富城畜牧有限公司。

1.1.3 试剂 所用培养基、生化反应管，购自青岛海博生物技术有限公司；PCR试剂，购自北京擎科生物科技有限公司；药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.2 产气荚膜梭菌的活菌计数 取回肠内容物1 g，用生理盐水进行10倍倍比稀释到106倍，取各稀释度稀释液按倾注平板法操作进行活菌计数[8]，42 ℃厌氧培养24 h，观察结果，选择菌落数在30～300的平板进行活菌计数。

1.2.3 细菌的生化试验 牛乳爆烈发酵试验：挑取纯化菌落，接种于装有含铁牛乳培养基的试管中。42 ℃厌氧培养12 h，观察结果。

微量发酵生化管鉴定：挑取纯化好的菌落分别接种在葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖、棉子糖、蛋白胨和明胶生化管中，37 ℃厌氧培养12 h。

1.2.4 细菌毒素的多重PCR鉴定 挑取分离纯化好的单菌落，利用煮沸法提取细菌的DNA作为模板，参照田冬青[9]针对产气荚膜梭菌的α、β、ε、τ四种毒素基因的特异性引物进行多重PCR扩增，根据多重PCR扩增的电泳结果进行产气荚膜梭菌的分型。

1.2.5 动物试验 取患病肉鸡肠道分离株单菌落接种FT培养基，厌氧培养8 h后，按1%比例接种疱肉培养基厌氧培养10 h后进行离心，分别取菌液离心上清液和疱肉培养基稀释菌体沉淀调整浓度为109CFU/mL的菌液腹腔注射小鼠各5只，每只200 μL，同时设注射等体积的疱肉培养基作为攻毒对照组。每组隔离饲养观察72 h，记录小鼠发病和死亡情况。

1.2.6 产气荚膜梭菌的药敏试验 选取分离的43株鸡源产气荚膜梭菌利用纸片扩散法进行药敏试验。选取苯唑西林、青霉素G、红霉素、大观霉素、万古霉素、克林霉素、四环素、米诺环素、诺氟沙星、环丙沙星、左氟沙星、新霉素、氨苄西林、头孢噻肟、卡那霉素15种药物进行药敏试验，根据《欧盟药敏试验标准》进行判定。

1.2.7 产气荚膜梭菌的16S rRNA基因序列扩增及进化树分析 选取13株自不同宿主和不同地区分离的产气荚膜梭菌与1株A型产气荚膜梭菌标准株利用16S rRNA基因的通用引物27 F和1492 R进行PCR扩增[10]。将与预期片段大小一致的PCR扩增产物送往上海派森诺生物股份有限公司进行测序。测序结果与NCBI核酸数据库进行Blast比对。对14株不同来源的产气荚膜梭菌的16S rRNA基因序列利用MEGA7.0进行遗传进化关系分析。

2 结果

2.1 菌落及菌体形态的观察 菌株在TSC培养基厌氧培养24 h后，菌落中间呈黑色，周围出现乳白色浑浊圈(见中插彩版图1A)。在绵羊血平板上形成灰白色、边缘整齐的大菌落，并产生双重溶血(见中插彩版图1B)。显微镜油镜下可见革兰阳性的两端钝圆的粗大杆菌(见中插彩版图1C)。

图1 菌落及菌体形态观察结果Fig.1 Results of colony and bacteria morphologyA:细菌在TSC平板的菌落形态； B:细菌在血平板的菌落形态； C:细菌镜检结果 (1 000×)A:Morphology of bacterial colony on TSC; B:Morphology of bacterial colony on blood plate; C:Microscopic results of bacterial staining (1 000×)

2.2 菌落计数结果 倾注平板法显示所检测的肠道内容物活菌数量均在106CFU/g以上，而健康鸡肠道内容物的活菌数量为102～103CFU/g。

2.3 细菌的生化鉴定 牛乳爆烈发酵试验结果表明：细菌在含铁牛乳培养基中培养12 h后，由于发酵牛乳中的乳糖并产生大量气体使牛乳凝固成海绵状(图2)。

图2 牛乳爆烈发酵试验Fig.2 Milk burst fermentation test1～4: 接种临床分离株； 5: 接种标准株； 6: 阴性对照1～4: Inoculation of clinical isolates;5: Inoculation of standard strains; 6: Negative control

生化试验结果如表1所示，根据《伯杰细菌鉴定手册》的鉴定标准，初步判定分离菌株为产气荚膜梭菌。

表1 分离株及标准株的生化特性鉴定统计Table 1 Statistical table for identification of biochemical characteristics of isolates and standard strains

2.4 细菌毒素的多重PCR检测 针对产气荚膜梭菌的α、β、ε、τ四种毒素基因对分离到的43株产气荚膜梭菌进行多重PCR鉴定分型的PCR凝胶电泳结果如图3所示，所有分离株均扩增出202 bp的单一条带，与A型产气荚膜梭菌毒素基因的扩增条带吻合，说明分离的菌株全部为A型产气荚膜梭菌。

图3 产气荚膜梭菌4种毒力基因的多重PCR鉴定Fig.3 Detection of 4 toxin genes of Clostridium perfringens by multiplex PCRM： DL-2 000； 1～11： 临床分离株； 12： A型标准株； 13： 阴性对照M： DL-2 000; 1～11： Clinical isolates;12： Standard strain of type A; 13： Negative control

2.5 动物试验结果 攻毒产气荚膜梭菌上清液组小鼠在14 h内全部死亡，而只攻毒细菌组与疱肉培养基对照组在整个观察期内未出现小鼠发病和死亡。对死亡小鼠进行剖检发现肠道出血现象明显，而攻毒细菌组和疱肉培养基对照组小鼠剖检肠道均正常。

2.6 不同来源产气荚膜梭菌的耐药性分析 药敏试验结果如图4所示，43株不同来源的菌株对红霉素、新霉素、卡那霉素有很高的耐药性，耐药率在80%以上，而对万古霉素、米诺环素、氨苄西林、头孢噻肟的耐药性相对较低。

图4 产气荚膜梭菌的药敏试验Fig.4 Results of susceptibility test of Clostridium perfringens

2.7 不同来源产气荚膜梭菌的16S rRNA进化树分析 选取前期不同宿主或不同地区分离的13株产气荚膜梭菌与1株A型产气荚膜梭菌标准株，利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，获得了预期约1 400 bp 的目的条带(图略)。将测序获得的16S rRNA 基因序列在GenBank进行Blast比对，结果表明，扩增的细菌均为产气荚膜梭菌，测序序列利用MEGA 7进行遗传进化分析(图5)。由系统进化树可知，临床分离的来自不同地区和不同宿主的A型产气荚膜梭菌基于16S rRNA基因序列水平上的进化关系没有明显规律，不同宿主来源的菌株反而比相同宿主来源的菌株亲缘关系更近。

图5 不同来源的产气荚膜梭菌16S rRNA序列进化树Fig.5 Phylogenetic tree by 16S rRNA of Clostridium perfringens from different sources

3 讨论

产气荚膜梭菌主要通过在肠道定殖后分泌毒素对肠黏膜造成损伤，引起坏死性肠炎的典型症状[11]。由于正常动物肠道中也可以分离到该菌，一般认为引起坏死性肠炎症状的数量需达到106CFU/g以上[8]，所以对临床可疑病例应进行该菌的活菌计数。本试验选择了倾注平板法进行活菌计数，相较其他菌落计数方法，结果更为可靠。在细菌分离过程中，不能单纯根据在TSC培养基上呈现周围有白色浑浊圈的黑色菌落特征作为判定产气荚膜梭菌的唯一依据，实验室曾分离到在TSC平板上具有该菌典型菌落特征但不能分解棉子糖和不产生爆烈发酵现象的菌株，经鉴定，该菌为爪状芽孢梭菌，所以需要结合生化试验和测序进行综合判断。对于产气荚膜梭菌的分型，Kokeala H A等[12]通过毒素中和试验与多重PCR比较发现2种方法的结果一致，相比较而言，多重PCR更省时省力且快速，所以多重PCR技术在临床应用中比毒素中和试验具有更大的优势。本试验分别通过注射细菌和上清液的方式对小鼠进行了攻毒，发现上清液是导致动物死亡的主要因素，进一步说明产气荚膜梭菌的毒素是主要致病因子。

本试验选取了临床常用的7类抗生素中的15种，通过纸片法药敏试验对不同宿主来源的产气荚膜梭菌进行的耐药性分析结果表明，分离菌株对选择的15种抗生素具有不同程度的耐药性。治疗产气荚膜梭菌引起的肠炎，青霉素是临床上常用药物，但极易产生耐药性，本试验分离到的菌株对青霉素的耐药率达到了23%，万古霉素作为一种超级抗生素，本试验分离到菌株对其全部敏感，并未发现超级耐药菌的出现。该药敏试验结果可对临床防治梭菌性肠炎提供一定的参考依据。系统进化树是检测物种进化关系的常用方法，本试验对不同地区和不同宿主来源的14株A型产气荚膜梭菌进行了16S rRNA基因系统进化树的构建，发现不同来源的菌株在分布地区、宿主来源没有明显的规律，即A型菌株即使来源不同，但同源性差异不大，说明该菌不具有宿主特异性，可能与来源于环境有关。另外，16S rRNA基因序列保守性较强，用于同源性较近的菌株分类具有一定局限性。