姜黄素对肿瘤相关巨噬细胞分泌细胞因子基因表达的影响

刘璐瑶 ,张雯雯,曹娟,李玮柏,孙宏晨,2,李波,2

（1.吉林大学口腔医院实验教学中心，吉林 长春 130021；2.中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院辽宁省口腔疾病重点实验室，辽宁 沈阳 110002）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，早期OSCC 患者5 年生存率为55%～60%，晚期OSCC 患者5 年生存率为30%～40%［1］。OSCC 的治疗，在其非特异性、非选择性和毒性方面仍存在巨大的挑战，多数患者在手术、化疗及放疗过程中出现严重不良反应，且后期易复发和转移［2］。OSCC 的形成过程中有活化的巨噬细胞参与，浸润巨噬细胞数量是OSCC 进展和预后的预测因子［3］。巨噬细胞在趋化因子的作用下浸润到肿瘤周围，在肿瘤微环境的作用下形成肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。TAMs 通过分泌多种因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等与肿瘤细胞进行交互作用，进而在肿瘤增殖、侵袭、转移和血管生成等过程中发挥作用。TAMs 分泌细胞因子的表达变化与其表型有密切关联，可以用于TAMs 表型转化和对M2 型TAMs 再教育研究［4-5］。姜黄素是姜黄的主要活性成分，是一种从天然植物姜黄根茎中提取出的多酚化合物。姜黄素具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用［6］。姜黄素对OSCC 的增殖、侵袭、转移和血管生成等有明显的抑制作用。研究［7］表明：姜黄素能通过抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和EGFR 下游信号分子蛋白激酶B（Akt），细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）和信号转录及转录激活因子3（STAT3）的磷酸化抑制OSCC 的增殖和侵袭；可以通过减少MMP2 和MMP9 及调节p53-E-钙黏蛋白途径抑制OSCC 的侵袭和上皮-间充质转化［8］；还能通过抑制辐射诱导的核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活性协同增强人OSCC 的放射敏感性［9］。姜黄素可以干预TAMs 分泌细胞因子的表达［10-11］。在白血病中，姜黄素通过Toll 样受体4（TLR4）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB通路降低TAMs肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素12B（interleukin-12B，IL-12B）的表达［10］；姜黄素能够促进肿瘤宿主巨噬细胞产生白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6 和TNF-α，抑制白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）和转化生长因子β（transforming growth factor，TGF-β）的生成［11］。但是，姜黄素对OSCC 中TAMs 分泌细胞因子的影响目前尚未见相关报道。因此，本文作者推测：姜黄素可能通过干预OSCC中TAMs分泌细胞因子的表达，进而抑制OSCC 的进展。本研究旨在通过探讨姜黄素对OSCC 肿瘤细胞上清液诱导的TAMs 分泌细胞因子基因表达的影响，进一步阐明姜黄素抗OSCC 作用机制，为OSCC 的治疗提供新的实验依据以及潜在的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人OSCC Cal27 细胞以及Raw264.7 巨噬细胞购自中国典型培养物宝藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），由吉林大学口腔医院实验教学中心进行传代培养。DMEM-高糖培养基（货号C11995500 BT，美国Gibco 公司），胎牛血清（货号04-001-1A）和青链霉素双抗（货号Hyc-SV30010）购自以色列BI 公司，姜黄素（货号C7727-500MG，美国Sigma 公司），CCK-8 试剂盒（K1018-5mL，美国APExBIO 公司），总RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和Real-time PCR 试剂盒（大连TaKaRa 公司）。实时荧光定量PCR 仪（美国安捷伦公司）。

1.2 细胞培养Cal27 细胞和Raw264.7 细胞均采用含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM高糖培养基在37°C、5% CO2且饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 肿瘤细胞上清液的收集及姜黄素和Cal27 细胞上清混合液的制备取对数生长期Cal27 细胞，接种到75cm2细胞培养瓶中，待细胞生长至约为80%融合率时换成10 mL 新鲜完全培养基继续培养，24 h 后收集上清液，500 g 离心5 min，弃掉沉淀收集上清，将上清液与新鲜完全培养基按7∶3比例配制。将姜黄素溶于配置后的Cal27 肿瘤细胞上清液中形成不同浓度的姜黄素和Cal27 细胞上清混合液。

1.4 CCK-8 法检测细胞活性取对数生长期Raw264.7 细胞，重悬成单细胞悬液，按每孔100 μL、2 000 个细胞数接种于96 孔细胞培养板内，随机分为对照组和实验组，每组设5 个复孔，用Cal27 细胞上清液孵育Raw264.7 细胞，实验组用不同浓度（1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 和40.00 μmol·L－1）姜黄素进行干预。待细胞贴壁状态稳定后，弃掉原培养基，按实验分组每孔加入100 μL 相应溶液，在培养箱中孵育48 h 后，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，继续孵育4 h，于酶标仪450 nm 处检测各孔吸光度（A）值。根据各孔A 值计算细胞存活率。细胞存活率＝（实验孔A值－空白孔A值）/（对照孔A值－空白孔A值）。

1.5 Real-time PCR 法检测细胞中TAMs 分泌细胞因子mRNA 表达水平取对数生长期Raw264.7 细胞，重悬成单细胞悬液接种于6 孔细胞培养板内，随机分为对照组和实验组，每组设3 个复孔，用Cal27 细胞上清液孵育Raw264.7 细胞，实验组用不同浓度（5、10 和20 μmol·L－1）姜黄素进行干预。根据试剂盒说明书提取总mRNA，测定mRNA 的浓度，按照逆转录试剂盒操作步骤将各组mRNA 反转录为cDNA。按照Real-time PCR 试剂盒步骤进行实验。各目的基因mRNA 相对表达水平采用2－ΔΔCT法计算。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列：β-actin，上游引物5'-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3'，下游引物5'-ATGCCACAGGATTCCATACC-3'；IL-10，上游引物5'-CTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTG-3'，下游引物5'-ATGTGGCTCTGGCCGACTGG-3'；IL-12，上游引物5'-ACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAG-3'，下游引物5'-TCTGAAGTGCTGCGTTGATGGC-3'；TNF-α，上游引物5'-CTCATGCACCACCATCAAGGACTC-3'，下游引物5'-AGACAGAGGCAACCTGACCACTC-3'；Arg-1，上游引物5'-TGCTCACACTGACATCAACACTCC-3'，下游引物5'-GGTCTACGTCTCGCAAGCCAATG-3'；iNOS，上游引物5'-TGCCACGGACGAGACGGATAG-3'，下游引物5'-CTCTTCAAGCACCTCCAGGAACG-3'。

1.6 统计学分析采用Graphpad Prism 5.0 统计软件进行统计学分析。各组Raw264.7 细胞存活率以及 Raw264.7 细胞分泌的 IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10 和Arg-1 mRNA 表达水平均符合正态分布，以表示。所有实验数据均是重复3 次以上的结果，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Raw264.7 细胞活性与对照组比较，1.25、2.50、5.00、10.00 和20.00 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞活性均有不同程度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；40 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞活性明显降低（P＜0.01）。因此后续实验将选取不加姜黄素组作为对照组，5、10 和20 μmol·L－1姜黄素组作为实验组进行干预。见表1。

2.2 TAMs 诱导过程中各组Raw264.7 细胞中IL-12、iNOS 和TNF-α mRNA 表达水平不同浓度姜黄素和Cal27 细胞上清液共同孵育Raw264.7 细胞36 h，与对照组比较，5 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中IL-12 mRNA 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），10 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中IL-12 mRNA 表达水平有上升趋势，但差异也无统计学意义（P＞0.05），20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中IL-12 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）；iNOS mRNA 表达水平均有不同程度降低，10 和20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中iNOS mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）；不同浓度姜黄素组Raw264.7细胞中TNF-α mRNA表达水平均有下降趋势，10 和20 μmol·L－1组TNF-α mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）。不同浓度姜黄素和Cal27 细胞上清液共同孵育Raw264.7 细胞48 h，与对照组比较，不同浓度姜黄素组Raw264.7 细胞中IL-12 mRNA 表达水平均有不同程度升高，5 和20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中IL-12 mRNA 表达水平升高（P＜0.01）；不同浓度姜黄素组Raw264.7 细胞中iNOS mRNA 表达水平均有下降趋势，其中5 和20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7细胞中iNOS mRNA 表达水平降低（P＜0.01）；不同浓度姜黄素组Raw264.7 细胞中TNF-αmRNA表达水平均降低（P＜0.01）。见表2。

表1 CCK-8 法检测各组Raw264.7 细胞活性Tab.1 Activities of Raw264.7 cells in various groups detected by CCK-8 assay(n=5,,η/%)

表1 CCK-8 法检测各组Raw264.7 细胞活性Tab.1 Activities of Raw264.7 cells in various groups detected by CCK-8 assay(n=5,,η/%)

*P＜0.01vscontrol group.

表2 各组Raw264.7 细胞中IL-12、iNOS 和TNF-α mRNA 表达水平Tab.2 Expression levels of IL-12,iNOS and TNF-α mRNA in Raw264.7 cells in various groups(n=3,x±s)

2.3 TAMs 诱导过程中各组Raw264.7 细胞中IL-10 mRNA 表达水平不同浓度姜黄素和Cal27 细胞上清液共同孵育Raw264.7 细胞36 h，与对照组比较，20 μmol·L－1组姜黄素Raw264.7细胞中IL-10 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）。不同浓度姜黄素和Cal27 细胞上清液共同孵育Raw264.7 细胞48 h，与对照组比较，不同浓度姜黄素组Raw264.7 细胞中IL-10 mRNA 表达水平均明显降低（P＜0.01）。见表3。

2.4 TAMs 诱导48 h 后加入姜黄素干预时各组Raw264.7 细胞中IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10 和Agr-1 mRNA 表达水平Cal27 细胞上清液孵育Raw264.7 细胞48 h 后，采用不同浓度的姜黄素进行干预，与对照组比较，10 和20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中IL-12 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01），iNOS mRNA 表达水平均明显降低（P＜0.01）；5 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中TNF-α mRNA表达水平降低（P＜0.05），10 和20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7 细胞中TNF-α mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）。与对照组比较，10 和20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-10 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01），5、10 和20 μmol·L－1姜黄素组Raw264.7细胞中Arg-1 mRNA 表达水平均明显降低（P＜0.01）。见表4。

表3 各组Raw264.7 细胞中IL-10 mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of IL-10 mRNA in Raw264.7 cells in various groups(n=3,)

表3 各组Raw264.7 细胞中IL-10 mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of IL-10 mRNA in Raw264.7 cells in various groups(n=3,)

*P＜0.01vscontrol group.

表4 TAMs 诱导48 h 后姜黄素作用下各组Raw264.7 细胞中IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10 和Agr-1 mRNA 表达水平Tab.4 Expression levels of IL-12,iNOS,TNF-α IL-10,and Arg-1 mRNA in Raw264.7 cells in various groups after TAMs induction for 48 h followed by curcumin treatment(n＝3,)

表4 TAMs 诱导48 h 后姜黄素作用下各组Raw264.7 细胞中IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10 和Agr-1 mRNA 表达水平Tab.4 Expression levels of IL-12,iNOS,TNF-α IL-10,and Arg-1 mRNA in Raw264.7 cells in various groups after TAMs induction for 48 h followed by curcumin treatment(n＝3,)

*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol group.

3 讨论

本研究选用Cal27 和Raw264.7 这2 种细胞系，采用Cal27 细胞上清液孵育Raw264.7 诱导形成TAMs；在TAMs 诱导过程中以及诱导48 h 后使用姜黄素进行干预，观察姜黄素对TAMs 分泌细胞因子基因表达的影响。

目前将巨噬细胞诱导成TAMs 的方式主要有2 种：一种是直接使用脂多糖（LPS）/γ-干扰素（IFN-γ）或白细胞介素4（IL-4）/ 白细胞介素13（IL-13）将巨噬细胞诱导成M1 或M2 表型的TAMs，如IL-4/ IL-13 刺激Raw264.7 细胞诱导成M2 型TAMs，经羧化多壁碳纳米管处理后M2 型TAMs向M1表型转化［12］；IL-4处理小鼠巨噬细胞诱导成M2 表型TAMs，LPS 诱导形成M1 表型TAMs，6-姜醇通过改变TAMs 极化状态，以防止氨基甲酸酯诱导的肺癌发生［13］；另一种是使用肿瘤上清液诱导巨噬细胞形成TAMs，如佛波酯处理的单核细胞系（THP-1）细胞与人A549 细胞培养上清液共培养48 h 诱导形成M2 型TAMs，观察SPP1 影响TAMs 极化并促进肺腺癌的免疫逃逸［14］；Raw264.7 巨噬细胞与4T1 细胞上清液共孵育72 h 后成功诱导成M2 型TAMs，观察肿瘤来源的透明质酸对巨噬细胞免疫抑制作用的影响［15］。使用LPS/ IFN-γ 或IL-4/ IL-13 诱导巨噬细胞极化不仅应用于肿瘤，还应用于炎症相关研究，但无法模拟肿瘤微环境，同时也无法体现不同肿瘤之间的差异性；使用不同肿瘤细胞上清液诱导巨噬细胞形成TAMs，能够真实还原巨噬细胞在不同肿瘤微环境中形成TAMs 的过程。本研究采用Cal27 上清液诱导TAMs，可以更好地模拟OSCC 肿瘤微环境中TAMs 的形成过程，确保实验数据翔实可靠。研究姜黄素对TAMs 分泌细胞因子基因表达的影响，有助于进一步阐明姜黄素抗OSCC 的作用机制。

TAMs 分泌的细胞因子，在肿瘤的进展中发挥着重要作用。在黑色素瘤中，Batf2 通过上调TAMs 分泌的IL-12 发挥其抗肿瘤的作用［16］；紫杉醇可以诱导TAMs 重新生成IL-12，纠正肿瘤诱导的免疫功能障碍，进而对抗纤维肉瘤［17］；IL-12 还具有诱导肿瘤细胞自噬、抑制肿瘤细胞转移及血管生成等作用［18］。TAMs分泌的TNF-α具有促进肿瘤生长及转移的作用，是多种癌症发生、增殖、转移和血管生成过程中的关键因子［19-21］。iNOS 与肿瘤的分化、转移及预后有密切关联［21］。在肿瘤微环境中，IL-10 表达水平升高可以激活STAT3 通路进而促进肝癌的浸润和转移［22］；IL-10 可以促进乳腺癌的免疫逃逸［23］；IL-10通过产生TNF 家族细胞活化因子BAFF 促进淋巴瘤的存活及发展［24］。Arg-1 在多种癌症中呈阳性表达，具有抑制免疫反应促进肿瘤生长的作用［25］。

本研究结果显示：姜黄素能上调TAMs分泌细胞因子IL-12 的表达水平，下调TNF-α、iNOS、IL-10 和Arg-1 表达水平。IL-12被称为重要的抗肿瘤细胞因子，通过不同的机制抑制肿瘤的发生发展［16-17］。姜黄素可能通过上调TAMs分泌细胞因子IL-12 表达进而抑制OSCC的进展。在OSCC发展过程中，阻断TNF-α 的生成可抑制肿瘤的血管生成及生长［19］；TNF-α诱导的miR-450a介导的TMEM182表达，以促进OSCC的运动［20］。姜黄素可能通过下调TNF-α的表达进而抑制OSCC的血管生成、生长及侵袭。iNOS对OSCC的发生发展起重要作用，可能通过下调iNOS 的表达进而与OSCC 的分化、淋巴结转移及预后有密切关联［21］。CD163+/CD204+M2型TAMs 通过产生IL-10和程序死亡配体1（PD-L1）作用于T细胞，促进OSCC 的侵袭和转移［26］。姜黄素可能通过下调IL-10 表达水平抑制OSCC 的侵袭和转移。Arg-1 具有抑制免疫反应促进肿瘤生长的作用［25］，还可能通过下调Arg-1 的表达抑制OSCC 生长。

研究［4，27］表明：中药可以通过调控TAMs 分泌细胞因子的表达干预TAMs 的表型变化。中药消水汤上调M2 型TAMs IL-12 的表达水平，下调IL-10 的表达水平，促进M2 型TAMs 向M1 表型极化［4］；三七通过上调M1型因子IL-1β、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、TNF-α 和iNOS 表达水平，下调M2 型因子IL-10 和YM-1 的表达水平，激活巨噬细胞向M1 表型极化抑制肿瘤生长［27］。与上述研究结果不同，本研究中姜黄素下调TNF-α和iNOS的表达水平。姜黄素可以下调小鼠巨噬细胞中TNF-α和IL-1β的产生并抑制NF-κB的活化，而TNF-α 和IL-1β是巨噬细胞中iNOS基因表达的关键，NF-κB对iNOS 的转录至关重要［28］；姜黄素是iNOS 激活的抑制剂，可以抑制iNOS 蛋白表达，姜黄素还降低肺泡巨噬细胞中TNF-α及NO的合成［29］。姜黄素可能通过上述途径下调TNF-α和iNOS 的基因表达。

本研究中，TAMs分泌的IL-12、IL-10和Arg-1表达水平的变化与TAMs 表型的转化有密切关联。在TAMs诱导过程中，姜黄素上调M1 型细胞因子IL-12 表达水平的同时，下调M2 型细胞因子IL-10的表达水平，表明姜黄素可能延缓了TAMs由M1型向M2型转化的过程；TAMs 诱导48 h 后使用姜黄素进行干预，M1型细胞因子IL-12表达水平上调，M2 型细胞因子IL-10和Arg-1表达水平下调，表明姜黄素可能对M2型TAMs再教育，使其由M2 型向M1型转变。上述结果表明：姜黄素可能从延长M1型TAMs持续时间和对M2 型TAMs再教育2个途径干预TAMs 表型变化，最大限度解除免疫限制，进而对抗OSCC。

综上所述，姜黄素可以调节TAMs 分泌细胞因子的基因表达，其可能通过干预IL-12、TNF-α、iNOS、IL-10 和Arg-1 在OSCC 中的作用以及TAMs 的表型变化，进而发挥其抗OSCC 作用。本研究有助于进一步阐明姜黄素抗OSCC 的作用机制，为OSCC 的治疗提供新的实验依据以及潜在的治疗策略。