刺五加根皮乙醇提取物和短梗五加根皮乙醇提取物对小鼠的镇静催眠作用及其机制

芮施 ,赵岩 ,王晶瑶,蔡恩博,祝洪艳,李平亚,刘金平

（1.吉林农业大学中药材学院中药化学教研室，吉林 长春 130118；2.吉林大学药学院人参创新药物开发国家地方联合工程研究中心，吉林 长春 130021）

刺五加（Acanthopanax senticosus）和短梗五加（Acanthopanax sessiliflorus）是广泛分布于我国东北林区的2 种五加科五加属重要珍贵灌木类药用植物。刺五加的干燥根和根茎或茎被2015 年版《中华人民共和国药典》收载，具有益气健脾、补肾安神之功效，是刺五加片等重要中成药的原料［1-2］。《吉林省药品标准1977》收载刺五加和短梗五加的干燥根皮为东五加皮，可祛风湿，壮筋骨，补肝肾。虽然短梗五加被列入吉林省药品标准，但目前短梗五加资源仍以新食品原料应用为主。民间把短梗五加干燥根与刺五加正品混用做刺五加，但缺少科学依据。此外，虽然刺五加分布广泛，资源丰富，但因其药用部位的相对不可再生性，药材质量常因生产年限不足，活性物质积累有限，部分以刺五加为原料药的制剂面临无合格药材可用的尴尬局面。在镇静安神药效研究方面，部分研究已证实了刺五加的镇静催眠作用［3-10］。相关研究［11-13］表明：刺五加及短梗五加中均含有大量的苷类物质，刺五加苷B 和E 及异嗪皮啶为主要的活性成分。鉴于刺五加原料药资源的相对不足，刺五加和短梗五加二者较近的亲缘关系、相近的生长环境和活性成分组成以及国内外对短梗五加根镇静催眠活性研究报道较少，本研究对比刺五加根皮和短梗五加根皮乙醇提取物的镇静催眠作用，探讨短梗五加根皮替代刺五加根皮的可行性，扩展刺五加药源。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器雄性昆明小鼠购自长春市亿斯实验动物科技有限公司，体质量18～22 g，动物生产许可证号：SCXK（吉）2016-0003；饲养条件：室温24℃～26℃，湿度55% ±5%，正常自由进食饮水，维持正常昼夜节律。刺五加根皮和短梗五加根皮（8 年生），由吉林省利生源生物制品有限公司提供，秋季挖根，洗净泥沙，剥皮，晒干；分别取干燥刺五加根皮和短梗五加根皮粉碎，过20 目筛，用10 倍量的95%乙醇超声提取2 次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，分别得到受试药刺五加根皮乙醇提取物（SENR，提取率5.52%）和短梗五加根皮乙醇提取物（SESR，提取率 3.85%）。地西泮（diazepam，DZP）由中国太原振兴制药有限公司提供，小鼠5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）ELISA 试剂盒购自南京建成有限公司，氟马西尼（flumazenil，FLU）、5-羟色氨酸（5-hydroxytryptophane，5-HTP）和戊巴比妥钠购自上海麦克林生化科技有限公司，PBS 缓冲液（pH7.2）购自海克隆生物化学制品（北京）有限公司。Avanti TM J-3OI 冷冻高速离心机购自美国BECKMAN 公司，Spectra MAX 190 酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司，ABS 320-4N 型分析天平购自上海岛韩实业有限公司，DY89-1 电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司，ZZ-6 小鼠自主活动测试仪购于成都泰盟软件有限公司。

1.2 自主活动仪检测小鼠自主活动次数选取120 只雄性昆明小鼠，随机分为12 组：空白对照组、DZP 组（3 mg·kg－1，灌胃给药）、不同剂量（4、8、16、32 和64 mg·kg－1）SENR 组和（4、8、16、32 和64 mg·kg－1）SESR 组，每组10 只。各受试药物均以蒸馏水为溶剂配制成适宜浓度，给药体积均为0.1 mL·10 g－1；空白对照组大鼠给予等体积的蒸馏水；SENR 组和SESR 组实验分别给予不同剂量SENR 和SESR，连续5 d，每天1 次；DZP 组前4 d 给予0.1 mL·10 g－1蒸馏水，最后1 d 灌胃给药3 mg·kg－1DZP。在最后一次小鼠给药30 min 后测量自主活动情况，将各组小鼠放置于自主活动记录仪中，在适应10 min 后进行记录，记录小鼠5 min 内的站立和活动次数。

1.3 亚催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠睡眠发生率的测定分组及前4 d 处理方法同“1.2”。第5 天给药前8 h 小鼠禁食不禁水，并在末次给药30 min 后，腹腔注射亚催眠剂量（28 mg·kg－1）戊巴比妥钠，观察并记录小鼠翻正反射消失情况，在30 min 内小鼠翻正反射消失达到1 min 以上者视为发生睡眠现象，计算睡眠发生率，小鼠睡眠发生率＝每组小鼠入睡只数/每组小鼠总只数×100%。

1.4 催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的测定分组及前4 d 处理方法同“1.2”。第5 天给药前8 h 小鼠禁食不禁水，在最后一次给药30 min 后，腹腔注射戊巴比妥钠（48 mg·kg－1），观察小鼠的睡眠情况，以小鼠从腹腔注射戊巴比妥钠到翻正反射消失的时间作为睡眠潜伏期，而从翻正反射的消失至恢复的时间作为小鼠的睡眠时间，记录各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间。

1.5 协同5-HTP 对亚催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的测定将60 只昆明小鼠随机分为6 组，每组10 只，分别为空白对照组、5-HTP（2.5 mg·kg－1，腹腔注射）组、SENR（4 mg·kg－1，灌胃给药）组、SENR（4 mg·kg－1，灌胃给药）+5-HTP（2.5 mg·kg－1，腹腔注射）组、SESR（4 mg·kg－1，灌胃给药）组和SESR（4 mg·kg－1，灌胃给药）+5-HTP（2.5 mg·kg－1，灌胃给药）组，SENR 和SESR 亚剂量由“1.2～1.4”实验检测得出。对各组小鼠连续灌胃给药5 d，给药容积均为0.1 mL·10 g－1，空白对照组和5-HTP 组小鼠每天给予等体积蒸馏水。第5 天给药前8 h 小鼠禁食不禁水，并在最后一次给药30 min后，对空白对照组和单独给予SENR、SESR 组以外的3 组小鼠腹腔注射5-HTP。15 min后，各组小鼠腹腔注射亚催眠剂量的戊巴比妥钠（28 mg·kg－1），观察各组小鼠翻正反射消失情况，记录睡眠小鼠数量，计算小鼠睡眠发生率。

1.6 协同5-HTP对催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的测定分组和给药同“1.5”。小鼠在第5 天给药前8 h 禁食不禁水，在最后一次给药30 min 后，对空白对照组、单独给予SENR 和单独给予SESR 组以外的3 组小鼠腹腔注射5-HTP。静待15 min 后，6 组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（48 mg·kg－1），观察各组小鼠的睡眠情况，记录其睡眠潜伏期和睡眠时间。

1.7 拮抗FLU 对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的测定60 只昆明小鼠随机分为6 组，每组10只，分别为空白对照组、FLU（8 mg·kg－1，腹腔注射）组、SENR（32 mg·kg－1，灌胃给药）组、SENR（32 mg·kg－1，灌胃给药）+FLU（8 mg·kg－1，腹腔注射）组、SESR（32 mg·kg－1，灌胃给药）组、SESR（32 mg·kg－1，灌胃给药）+FLU（8 mg·kg－1，腹腔注射）组，SENR 和SESR的催眠剂量由“1.2～1.4”实验得出。实验给药持续5 d，每天1 次，各组小鼠每次给药体积为0.1 mL·10 g－1，空白对照组和FLU 组小鼠给予等体积蒸馏水。第5 天给药前8 h 小鼠禁食不禁水，最后一次给药30 min 后，对空白对照组、SENR 单独给药组和SESR 单独给药组以外的3 组小鼠腹腔注射FLU（8 mg·kg－1）。静待15 min 后，6 组小鼠腹腔注射催眠剂量的戊巴比妥钠（48 mg·kg－1），观察各组小鼠的睡眠情况，记录其睡眠潜伏期和睡眠时间。

1.8 ELISA 法检测各组小鼠脑组织中5-HT 和GABA 水平“1.6 和1.7”实验观察结束后，分离各组小鼠脑组织，称质量，加入9 倍体积的冰冷PBS 缓冲液（pH7.2），匀浆，4℃、1 000 r·min－1离心15 min，取上清液，采用ELISA 试剂盒检测上清液中5-HT 和GABA 水平。

1.9 统计学分析采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。各组小鼠自主活动次数、睡眠潜伏期和睡眠时间均符合正态分布，以表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠自主活动次数与空白对照组比较，DZP 组小鼠自主活动次数减少（P＜0.01），不同剂量（8、16、32 和64 mg·kg－1）SENR 组和不同剂量（8、16、32 和64 mg·kg－1）SESR 组小鼠自主活动次数明显减少（P＜0.05 或P＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠的自主活动次数Tab.1 Number of locomotor activities of mice in various groups（n＝10,）

表1 各组小鼠的自主活动次数Tab.1 Number of locomotor activities of mice in various groups（n＝10,）

*P＜0.05，**P＜0.01vsblank control group.

2.2 亚催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验各组小鼠睡眠发生率与空白对照组比较，在亚剂量（28 mg·kg－1）戊巴比妥钠的诱导下，DZP 组小鼠睡眠发生率提升到100%，不同剂量（4、8、16、32 和64 mg·kg－1）SENR 组和不同剂量（8、16、32 和64 mg·kg－1）SESR 组小鼠睡眠发生率升高，且存在一定剂量依赖性，SENR 和SESR 剂量达到32 mg·kg－1时小鼠睡眠发生率达到最大值。见表2。

2.3 催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间与空白对照组比较，在催眠剂量戊巴比妥钠（48 mg·kg－1）诱导下，DZP 小鼠睡眠潜伏期缩短（P＜0.01），睡眠持续时间延长（P＜0.01）；不同剂量（8、16、32 和64 mg·kg－1）SENR 组和不同剂量（8、16、32 和64 mg·kg－1）SESR 组小鼠睡眠潜伏期缩短（P＜0.05 或P＜0.01），睡眠持续时间延长（P＜0.05 或P＜0.01），且存在一定的剂量依赖性，SENR 和SESR 剂量达到32 mg·kg－1时与空白对照组比较差异最明显。见表3。综合“2.1～2.3”的实验结果，选择SENR 和SESR 的亚催眠剂量为4 mg·kg－1，催眠剂量为32 mg·kg－1。

表2 亚催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠的睡眠发生率Tab.2 Incidence of sleep of mice in sub-hypnotic dose of pentobarbital sodium-induced sleep experiment in various groups(n=10,η/%)

2.4 协同5-HTP 后亚催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠睡眠发生率与空白对照组比较，在亚催眠剂量戊巴比妥钠（28 mg·kg－1）诱导下，5-HTP（2.5 mg·kg－1）组、SENR（4.0 mg·kg－1）组、SESR（4.0 mg·kg－1）组、SENR+5-HTP 组和SESR+5-HTP 组小鼠睡眠发生率升高（P＜0.01）；分别与单独给药SENR 组和单独给药SESR 组比较，协同给药SENR+5-HTP 组和SESR+5-HTP 组小鼠睡眠发生率升高（P＜0.01）。见表4。

表3 催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时间Tab.3 Sleep latencies and sleep time of mice in hypnotic dose of pentobarbital sodium-induced sleep experiment in various groups(n＝10,,t/min)

表3 催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时间Tab.3 Sleep latencies and sleep time of mice in hypnotic dose of pentobarbital sodium-induced sleep experiment in various groups(n＝10,,t/min)

*P＜0.05，**P＜0.01vsblank control group.

表4 戊巴比妥钠诱导5-HTP 协同给药小鼠的睡眠指标Tab.4 Sleep indexes of mice induced by pentobarbital sodium in combination with 5-HTP in various groups(n＝10,)

表4 戊巴比妥钠诱导5-HTP 协同给药小鼠的睡眠指标Tab.4 Sleep indexes of mice induced by pentobarbital sodium in combination with 5-HTP in various groups(n＝10,)

*P＜0.01vsblank control group；ΔP＜0.01vsSENR group；#P＜0.01vsSESR group.

2.5 联合5-HTP 后催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间与空白对照组比较，在催眠剂量戊巴比妥钠（48 mg·kg－1）诱导下，SENR+5-HTP 组和SESR+5-HTP 组小鼠睡眠潜伏期缩短（P＜0.01），睡眠持续时间延长（P＜0.01）。分别与SENR 组和SESR 组比较，SENR+5-HTP 组和SESR+5-HTP 组小鼠睡眠潜伏期缩短（P＜0.01），睡眠持续时间延长（P＜0.01）。见表4。

2.6 联合5-HTP 后催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠脑组织中5-HT 水平与空白对照组比较，在催眠剂量戊巴比妥钠（48 mg·kg－1）诱导下，SENR+5-HTP 组和SESR+5-HTP 组小鼠脑组织中5-HT 水平升高（P＜0.01）。分别与SENR 组和SESR 组比较，SENR+5-HTP 组和SESR+5-HTP 组小鼠脑组织中5-HT 水平升高（P＜0.01）。见表4。

2.7 联合FLU 后催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间与空白对照组比较，在催眠剂量戊巴比妥钠（48 mg·kg－1）诱导下，FLU 组小鼠睡眠潜伏期延长（P＜0.01），睡眠持续时间缩短（P＜0.01）；SENR 组（32 mg·kg－1）和SESR 组（32 mg·kg－1）组小鼠睡眠潜伏期缩短（P＜0.01），睡眠持续时间延长（P＜0.01）。分别与SENR 组和SESR 组比较，SENR+FLU 组和SESR+FLU 组小鼠睡眠潜伏期延长（P＜0.01），睡眠持续时间缩短（P＜0.01）。见表5。

2.8 催眠剂量SENR 和SESR 拮抗FLU 作用下催眠小鼠脑组织中GABA 水平与空白对照组比较，在催眠剂量戊巴比妥钠（48 mg·kg－1）诱导下，FLU 组小鼠脑组织中GABA 水平降低（P＜0.05），SENR 组（32 mg·kg－1）和SESR 组（32 mg·kg－1）组小鼠脑组织中GABA 水平升高（P＜0.01）。分别与SENR 组和SESR 组比较，SENR+FLU 组和SESR+FLU 组小鼠脑组织中GABA 水平降低（P＜0.05）。见表5。

表5 FLU 联合催睡剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠的睡眠指标Tab.5 Sleep indexes of mice in hypnotic dose of pentobarbital sodium-induced sleep experiment combined with FLU in various groups(n＝10,)

表5 FLU 联合催睡剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中各组小鼠的睡眠指标Tab.5 Sleep indexes of mice in hypnotic dose of pentobarbital sodium-induced sleep experiment combined with FLU in various groups(n＝10,)

*P＜0.05，**P＜0.01vsblank control group；ΔP＜0.01vsSENR group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01vsSESR group.

3 讨论

由于对刺五加长期过度无序的掠夺式采茎挖根行为，造成药材质量严重下降，部分以刺五加为原料药的制剂面临无合格药材可用的尴尬局面。为了探索以与刺五加亲缘关系和生长环境最为接近的短梗五加替代刺五加的可行性，本课题组在查阅前期研究文献和结合前期实验室研究基础上，对比SENR 和SESR 的镇静催眠活性及其初步作用机制进行了对比研究。

在用于评价镇静和催眠活性的药理学方法中，自主活性实验和戊巴比妥钠诱导的睡眠实验是2 种最经典的睡眠行为评价方法［14］。实验动物自主活动的减少通常被认为是镇静的标志［15］。本研究结果表明：8～64 mg·kg－1剂量的SENR 和SESR（折合刺五加原药材145～1 160 mg·kg－1，折合短梗五加原药材208～1 660 mg·kg－1）均可降低正常小鼠的自主活动，表现出镇静作用，二者表现出相近的作用趋势。协同亚催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠发生率，以及协同催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间是评价药物催眠作用的重要指标［14］。本研究结果表明：8～64 mg·kg－1SENR 和SESR 可有效提高戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠发生率，缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间，表明SENR 和SESR 均具有催眠作用，且二者表现出相近的作用效果和作用趋势，均在32 mg·kg－1剂量下表现出最佳作用效果，折合原药材分别为刺五加580 mg·kg－1、短梗五加830 mg·kg－1，对于人体（按70 kg 体质量计算）则分别为刺五加4.5 g·d－1、短梗五加6.5 g·d－1。本研究中刺五加根的镇静催眠作用研究结果与以往的研究有所差异，如胡文婷等［16］的研究结果表明：刺五加可明显地延长戊巴比妥钠引起的小鼠睡眠时间，而对小鼠睡眠潜伏期无影响，其原因与药材提取方法有关，本研究对象为乙醇提取物，而文献［4］报道的为水煎剂。

5-HT 又名血清素，是一种单胺类神经递质，有助于感受幸福和快乐，改善睡眠，调节认知、记忆和许多生理过程［4］。5-HTP 在人体内可作为5-HT 的前体物质，而5-HT 在体内可合成褪黑素（MT），进而发挥对睡眠的调整作用［17］。本研究结果表明：亚催眠剂量的SENR 和SESR 均能够协同5-HTP 明显地提高亚催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠发生率，缩短催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期和延长睡眠持续时间，提高小鼠脑组织中5-HT 水平，表明中枢5-HT 能神经系统参与了SENR 和SESR 的催眠作用。有研究［18-19］显示：刺五加水煎液协同5-HT 前体物质5-HTP 发挥改善睡眠作用［4］。GABA 是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质之一，是调节神经元兴奋性的关键信号分子。GABA 能够与大脑突触后神经细胞膜上的GABA 受体（苯二氮卓类受体）和巴比妥受体紧密相连，组成GABA/BZ 复合体，共同调节氯离子（Cl－）通道，当GABA/BZ 受体被激活，Cl－通道开放大量Cl－内流，导致神经细胞膜过度极化而不易除极，神经冲动传导被抑制；而FLU是GABA/BZ 受体的常用抑制剂［20］。本研究结果表明：FLU 能够有效阻断催眠剂量SENR 和SESR的催眠作用及SENR 和SESR 诱导的脑内GABA 水平升高，提示SENR 和SESR 的催眠作用与中枢GABA 能神经系统有关。本研究结果与杨婷婷等［21］和董梅［4］的研究结果类似，杨婷婷等［21］的研究指出：刺五加有效部位可以增强GABA 的表达，董梅［4］的研究指出：GABA 能神经系统介导了刺五加的改善睡眠作用，刺五加水煎液通过上调苯二氮卓类受体、协同5-HT 前体物质5-HTP 发挥改善睡眠作用。

综上所述，本研究填补了SESR 镇静催眠作用及机制研究的空白。本研究结果表明：SENR 和SESR 均具有镇静催眠作用，其作用机制均与其上调脑组织中5-HT 和GABA 水平有关；在镇静催眠方面，短梗五加根皮可作为刺五加根皮的替代品。本研究结果也表明：短梗五加根皮和刺五加根皮的镇静催眠作用和机制仍存在一定的差异，将在后续的实验中进行深入研究。