载阿霉素细胞膜纳米囊泡对黑色素瘤B16F10 细胞的杀伤效应

杨泽斌,王明月,陈丽,刘宁,王浩,崔梅英,方楷漪,夏薇,关新刚

（北华大学医学技术学院肿瘤靶向治疗重点实验室，吉林 吉林 132013）

阿霉素（doxorubicin，DOX），又称多柔比星，是一种具有广谱抗肿瘤活性的蒽环类抗生素，广泛应用于乳腺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、胆管癌和前列腺癌等实体瘤及多种血液系统恶性肿瘤的治疗。尽管在多种肿瘤中显现出良好的治疗效果，但DOX 用药过程中产生的心脏毒性及骨髓抑制等严重不良反应限制了其在临床上的进一步应用［1］。提高DOX 的靶向肿瘤输送效率并降低对正常组织的不良反应成为改善治疗效果的关键。近年来，基于纳米颗粒的药物递送系统引起了广泛关注［2］，与游离小分子药物比较，纳米药物递送系统具有药物代谢时间延长、肝肾组织吸收降低、高通透性和滞留（EPR）效应［3-5］等优势。多项研究［6-8］显示：利用细胞膜为原材料制备的纳米囊泡具有极佳的生物相容性，可作为一种高效安全的药物递送系统用于抗肿瘤研究。细胞膜纳米囊泡担载紫杉醇（paclitaxel，PTX）用于恶性胶质母细胞瘤治疗，与小分子PTX 比较，纳米药物能明显延长药物的体内循环时间并减轻不良反应［9］；此外，利用膜囊泡作为siRNA 递送载体，能够改善siRNA 在血液中的快速降解，明显抑制c-Myc 基因表达［10］。本研究利用人胚肾细胞HEK293T 的细胞膜制备一种细胞膜纳米囊泡（nanovesicle，NVs），通过电穿孔法将DOX 担载于囊泡内腔，得到新型阿霉素纳米药物NVs-DOX，探讨纳米药物NVs-DOX 对黑色素瘤B16F10 细胞的内吞作用及杀伤效应，为开发高效低毒的新型抗癌药提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器小鼠黑色素瘤B16F10 细胞、人胚胎肾细胞HEK293 和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3 由本实验室保存。DOX、MTT、PMSF、DAPIT 和BCA 蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术公司，二甲基亚砜（DMSO）、DMEM 和胎牛血清（FBS）购于生工生物工程（上海）股份有限公司，活/死细胞活力检测试剂盒购于凯基生物。纳米粒度及Zeta 电位分析仪Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ（美国麦奇克有限公司），LF10 脂质体挤出仪（加拿大AVESTIN 公司），M200 多功能酶标仪（瑞士TECAN 公司），CUY21EDIT Ⅱ细胞电转化仪（日本BEX 公司），紫外分光光度计（上海仪电INESA 有限公司），ACEA NovoCyte 序列流式细胞仪和倒置荧光显微镜（美国Lifte-Technologies 公司）。

1.2 细胞培养细胞在37℃、5%CO2培养箱孵育，用含10%FBS 和1% 双抗混合液（penicillinstreptomycin solution）的DMEM 培养基培养。

1.3 细胞膜NVs制备将对数生长期的HEK293T 细胞进行消化后，离心收集细胞沉淀用PBS 缓冲液洗涤3 次（1 500 r·min－1，5 min），使用HM 培养基（1 mmol·L－1EDTA、20 mmol·L－1Hepes-NaOH、pH7.4、1 mmol·L－1PMSF）进行重悬，冰上使用匀浆器挤压50 次，1 500 r·min－1离心10 min，收集上清超高速离心（35 000 r·min－1，2 h）收集沉淀，PBS 缓冲液重悬3 次后顺序通过装有1 μm 和0.4 μm 滤膜的挤出仪挤压20 次，得到细胞膜NVs，利用BCA 蛋白定量试剂盒检测囊泡中蛋白浓度，细胞膜NVs 浓度以蛋白浓度（mg·L－1）表示。使用Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ检测NVs的粒径分布。

1.4 MTT 法分析NVs 的细胞相容性取对数生长期小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3，消化后接种于96 孔细胞培养板，37℃、5%CO2培养箱孵育24 h后每孔加入终浓度分别为0、5、10、20、50 和100 mg·L－1（蛋白浓度）的NVs，37℃、5%CO2培养箱培养48 h 后每孔加入20 μL MTT（5 g·L－1）溶液，继续培养4 h 后弃去孔中溶液，加入150 μL DMSO，震荡1 min 后检测490 nm 处吸光度（A）值并计算细胞存活率。细胞存活率＝NVs 组A 值/空白组A 值×100%。

1.5 纳米药物NVs-DOX 的制备利用电转法将DOX 担载于细胞膜内腔：CUY21EDIT Ⅱ细胞电转化仪电击杯（内径尺寸为0.4cm）加入细胞膜NVs 与DOX（质量比为2∶1），电转条件为PPV：200 V，On：10 ms，Off：10 ms，PdV：25 V，On：50 ms，Off：50 ms，C：940 μF，Cycle：10。冰上孵育30 min，35 000 r·min－1超高速离心2 h 后将沉淀重悬于PBS 缓冲液，得到NVs-DOX；孵育方法装载DOX，将细胞膜与DOX（质量比2∶1）37℃孵育2 h，PBS 缓冲液洗涤3 次后重悬，利用DOX 在485 nm 吸光度（A）值绘制标准曲线，对上述2 种方法制备的纳米药物DOX 浓度进行定量。使用Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ测定NVs-DOX 的粒径分布。

1.6 激光共聚焦成像检测细胞中荧光分布将对数生长期的黑色素瘤B16F10 细胞消化后，接种于24 孔细胞培养板中，37℃、5%CO2培养箱孵育12 h 后，分别加入10 mg·L－1（DOX 浓度）的小分子DOX 或NVs-DOX，37℃孵育3 h 弃去孔中培养液，PBS 缓冲液清洗3 次后4%多聚甲醛37℃固定20 min，PBS 缓冲液清洗3 次后DAPI 室温染色10 min，PBS 缓冲液清洗3 次后封片于荧光显微镜（Zeiss）下成像。采用Image J 软件分析图片荧光强度。

1.7 流式细胞术检测细胞中荧光强度将B16F10 细胞接种于6 孔细胞培养板中，每孔1.8×105个细胞，37℃、5%CO2培养箱孵育24 h 后，分别加入10 mg·L－1（DOX 浓度）的小分子DOX 或NVs-DOX，37℃孵育3 h 后胰蛋白酶消化，1 500 r·min－1离心5 min，收集细胞沉淀，PBS 缓冲液清洗3 次后加入500 μL PBS 缓冲液轻轻混匀重悬，采用流式细胞仪检测并分析B16F10 细胞内吞后的荧光强度。

1.8 MTT 法检测NVs-DOX 作用后B16F10 细胞存活率取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16F10 细胞，接种于96 孔细胞培养板中，每孔1×104个细胞，37℃、5%CO2培养箱孵育24 h 后，实验组每孔加入100 μL NVs-DOX，药物终浓度分别为0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 和1.000 μmol·L－1，对照组加入相同终浓度的游离DOX，每组设置5 个重复孔，37℃、5%CO2培养箱培养48 h。弃上清，加入20 μL MTT（5 g·L－1），37℃、5%CO2孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μL DMSO，使用全波长多功能自动酶标仪检测490 nm 处A 值，计算细胞存活率。细胞存活率＝药物处理组A 值/空白对照组A 值×100%。

1.9 活/死细胞染色检测NVs-DOX 对B16F10 细胞的毒性取对数生长期的黑色素瘤B16F10 细胞，接种于96 孔细胞培养板中，每孔1×104个细胞，37℃、5%CO2培养箱孵育24 h 后，分别加入含有1 μmol·L－1DOX 的小分子DOX 及NVs-DOXs，37℃、5%CO2培养箱培养24 h，弃去培养基后PBS缓冲液冲洗2 次，加入活/死细胞活力检测试剂盒进行染色，荧光显微镜成像，使用Image J 软件分析数据。计算各组死细胞占总细胞比率。

1.10 统计学分析采用Graphpad Prism 5.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞存活率、载药效率、荧光强度和死细胞占总细胞比率经正态分布检验均呈正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，2 组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞膜NVs 的制备通过超速离心法得到HEK293 细胞的细胞膜，脂质体挤出仪处理后得到细胞膜NVs，动态光散射检测结果显示：NVs 平均粒径为254.3 nm（图1）。MTT 法检测结果显示：随着NVs 浓度逐渐增加，NVs 不仅未显示出细胞毒性，而且在一定程度上促进了NIH3T3 细胞的增殖（细胞存活率＞120%）（表1），显示出良好的生物相容性。

图1 细胞膜NVs 的粒径分布Fig.1 Size distribution of cell membrane NVs

表1 细胞膜NVs 与NIH3T3 细胞的生物相容性Tab.1 Biocompatibilities of cell membrane NVs and NIH3T3 cells(n＝5,，η/%)

表1 细胞膜NVs 与NIH3T3 细胞的生物相容性Tab.1 Biocompatibilities of cell membrane NVs and NIH3T3 cells(n＝5,，η/%)

2.2 纳米药物NVs-DOX 的制备动态光散射检测结果显示：装载DOX 后的NVs 平均粒径为289.6 nm（图2），较空NVs 粒径（254.3 nm）略大。电转法DOX 担载效率（24.91%±2.26%）高于孵育法（15.10%±0.73%，P＜0.05），与参考文献［11］报道一致，因此在后续研究中均采用电转法进行药物担载。

图2 纳米药物NVs-DOX 的粒径分布Fig.2 Size distribution of NVs-DOX

2.3 激光共聚焦成像和流式细胞术检测NVs-DOX 的肿瘤细胞内吞荧光成像检测结果显示：药物孵育3 h 后小分子DOX 和纳米药物NVs-DOX均可以快速进入胞内，主要分布在细胞核中（图3）；荧光定量分析显示：小分子DOX 组细胞的荧光强度（38.81±1.58）高于NVs-DOX 组（30.20±3.81）（P＜0.05）。流式细胞术检测结果显示：小分子DOX 细胞内吞效率（95.47%±1.32%）高于NVs-DOX组（91.07%±0.42%），与荧光成像结果一致，见图4。

2.4 MTT 法和活死细胞染色法检测NVs-DOX 对黑色素瘤B16F10 细胞的毒性MTT 法检测结果显示：随着药物浓度增加，小分子DOX 和NVs-DOX 处理的细胞存活率均逐渐降低；不同浓度NVs-DOX 组细胞存活率与相对应浓度小分子DOX 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图5）。活/死细胞染色法检测结果显示：处理24 h 后小分子DOX 组与NVs-DOX 组死细胞占总细胞比率分别为（41.14±3.13）%和（43.38±5.41）%（图6），2 组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

晚期黑色素瘤由于高侵袭性和强转移性，其临床治疗仍是一个亟待解决的难题［12］。降低DOX 的严重不良反应成为影响治疗效果的关键问题［13］。近年来基于纳米颗粒的药物递送系统取得了重要进展，已开发出脂质体纳米粒、纳米胶束、纳米囊泡、金纳米颗粒和介孔纳米硅球等载药体系用于靶向肿瘤递送DOX 研究［14-19］。然而药物载体在体内的代谢去向及安全性仍是不容忽视的问题。

图4 流式细胞术检测NVs-DOX 的黑色素瘤B16F10 细胞内吞Fig.4 Endocytosis of melanoma B16F10 cells of NVs-DOX detected by flow cytometry

图5 MTT 法检测各组黑色素瘤B16F10 细胞存活率Fig.5 Survival rates of melanoma B16F10 cells in various groups detected by MTT method

细胞膜来源的NVs 由于其独特的材料特性在药物输送领域引起了广泛关注［20］。研究［21］显示：利用细胞膜制备的NVs 担载姜黄素不仅能够改善姜黄素药物溶解度差的问题，还能延长姜黄素的体内循环时间，取得了较游离药物更好的治疗效果。细胞膜NVs 作为药物递送载体可以降低肝肾组织对药物的清除，从而降低药物对正常组织的不良反应［11，22-23］。由于胚胎肾细胞分化程度较低，基本不表达胞外配体所对应的受体分子，因而具有较低的免疫原性，因此本研究采用人胚肾HEK293 细胞的细胞膜作为原材料制备NVs，利用其担载并递送DOX 用于抗黑色素瘤细胞的研究。本研究结果表明：NVs 与NIH3T3 细胞具有良好的生物相容性；短时间（3 h）内纳米药物NVs-DOX 内吞效率略低于小分子DOX，与其通过自由扩散的方式快速入胞有关，纳米药物主要以内吞方式进入胞内，速度较自由扩散稍慢；但48 h 处理结果显示：纳米药物NVs-DOX 具有与小分子DOX 相当的肿瘤细胞毒性，提示纳米药物NVs-DOX 具有高效杀伤黑色素瘤B16F10 细胞的特性。

综上所述，本研究成功制备了基于细胞膜NVs的纳米药物NVs-DOX，细胞膜NVs 在成纤维细胞上显示出良好的生物相容性，纳米药物NVs-DOX可被黑色素瘤B16F10 细胞高效内吞并展示出与小分子DOX 相当的肿瘤细胞杀伤效应。本研究为开发高效低毒的新型抗癌药提供了新思路。