产KPC-2耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌ST2237与ST11的分子流行特征分析*

王媛媛，胡红霞，郭海军，梁建红，王启

(1.河南科技大学第一附属医院a.检验科，b.感染控制科，河南洛阳 471003；2.北京大学人民医院检验科， 北京 100044)

肺炎克雷伯菌广泛存在于环境中，是临床感染常见病原菌。近年来，全球耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumonia，CRKP)的广泛传播及其感染所引发高致死率和高治疗支出对世界公共卫生造成严重威胁[1]。目前我国以产KPC-2肺炎克雷伯菌的ST11型为主要流行株[2]，但一些非ST11型的新序列株也不断涌现和增多，如产NDM-1的ST571、产KPC-2的ST48等[3-4]。而关于ST2237型CRKP的系统研究较少[5]。本研究旨在了解ST2237型与ST11型CRKP的流行病学特点。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集河南科技大学第一附属医院2018年1月至12月分离的非重复碳青霉烯类抗菌药物不敏感(亚胺培南、美罗培南、厄他培南中至少一种不敏感)肺炎克雷伯菌株63株。分离自下呼吸道49株、伤口5株、血液3株、导管3株、尿液2株和脑脊液1株。用Vitek 2 Compact全自动分析仪鉴定到种，并经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪Vitek MS复核。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853均由国家卫健委临床检验中心提供。blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaDHA、blacmy和mcr-1基因PCR阳性对照菌株由北京大学人民医院检验科馈赠。

1.2主要试剂与仪器 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪Vitek MS及配套试剂、Vitek 2 Compact全自动细菌分析仪及配套GNI鉴定卡、AST-GN09和AST-GN335药敏板卡(法国生物梅里埃公司)，PCR扩增仪、脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像仪(美国UVP公司)；Premix TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)，M-H琼脂(英国Oxoid公司)，美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、米诺环素、氯霉素等抗菌药物(中国药品生物制品检定所)，多黏菌素E(美国Sigma公司)，替加环素(美国辉瑞公司)，阿维巴坦(美国 BioVision 公司)。

1.3药敏试验 用琼脂稀释法进行常用抗菌药物敏感性试验，多黏菌素E和磷霉素采用欧洲EUCAST标准[6]判读，其余药物参照2019年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)M100标准[7]进行判读；用微量肉汤稀释法测定替加环素最低抑菌浓度(minimun inhibitory concentration,MIC)，参照美国食品药品监督管理局标准[8]进行判读。头孢他啶/阿维巴坦测定时，每个头孢他啶浓度中加入固定终浓度的阿维巴坦(4 mg/L)。

1.4耐药基因扩增及测序 用煮沸法[9]提取菌株DNA。参照文献[10-16]设计引物，引物由北京擎科公司合成，见表1。用PCR法扩增耐药基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaDHA、blacmy和mcr-1。反应体系为25 μL，包括Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物(50 μmol/L)各0.2 μL、模板2 μL、ddH2O 10.1 μL。反应条件: 95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54～66 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后送北京擎科公司采用双脱氧链末端终止法双向测通，测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(www.ncbi.nlm.gov/blast)中进行BLAST比对，采用CLC Sequence Viewer 8软件进行分析。

1.5毒力基因检测 用PCR和基因测序方法检测肺炎克雷伯菌毒力相关基因iucA、rmpA2、rmpA、iroN，引物及扩增条件参照文献[17]。扩增产物送北京擎科公司进行测序，测序结果在NCBI网站进行BLAST比对。

1.6多位点序列分型(multilocus sequencing typing,MLST) 参照法国巴斯德研究所网站资料(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)，对肺炎克雷伯菌7个管家基因gapA、infB、mdn、pgi、phoE、rpoB、tonB合成引物并进行PCR扩增后送北京擎科公司测序，测序结果于上述网站数据库比对出菌株相应的ST分型。使用goeBURST软件(http://goeburst.phyloviz.net/)进行种群结构和进化模式分析。

1.7统计学分析 用SPSS 22.0软件进行。非正态分布计量资料以中位数(四分位数)表示，两组间比较用Mann-WhitneyU检验；率的比较用Fisher′s精确检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 耐药基因引物序列及反应条件

2 结果

2.1药敏试验结果 CRKP菌株对检测的所有β-内酰胺类药物均耐药；对阿米卡星、磷霉素、氯霉素、米诺环素、多黏菌素E和替加环素耐药率分别为97%、94%、78%、43%、1.6%和1.6%；对头孢他啶/阿维巴坦均敏感。

2.2耐药基因结果 63株菌株均检出blaKPC-2、blaTEM和blaSHV，检出blaDHA6株，检出blaCTX-M55株。未检出blaNDM、blaIMP、blacmy和mcr-1。

2.3毒力基因结果 63株菌株中49株(77.8%)携带毒力基因，其中携带iucA、iroN、rmpA、rmpA24种毒力基因15株，携带iucA、rmpA、rmpA23种基因1株，携带iucA和rmpA22种基因26株，携带rmpA和rmpA22种基因1株，携带iucA和rmpA2株基因6株。未检出上述4种基因14株。

2.4MLST分型 63株肺炎克雷伯菌检出3种ST，包括ST11 55株(87.3%)、 ST2237 7株(11.1%)和ST2894 1株(1.6%)。利用goeBURST软件绘图展示ST11、ST2237及ST2894与国内报道产KPC-2的CRKP部分ST型间的进化和种群关系，显示ST11与ST2894为同一进化谱系，而与ST2237不在同一进化谱系中。见图1。

注：方框标注为本文检出ST。

2.5ST2237和ST11菌株特征比较 美罗培南、厄他培南、替加环素、头孢他啶/阿维巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、米诺环素和氯霉素MIC分布在ST2237型菌株结果低于ST11型菌株，差异有统计学意义(Z分别为-4.146、-4.535、-2.893、-4.635、-7.803、-6.699、-7.797、-2.223、-3.395，P<0.05)。见表2。

表2 ST2237和ST11型CRKP的MIC值(mg/L)

blaDHA在ST2237株中的携带率为85.7%(6/7)，高于ST11株中携带率0(0/55)，差异有统计学意义(Fisher′s精确检验，P=0)；blaCTX-M在ST2237株中的携带率为0(0/7)，低于ST11株中的携带率98%(54/55)，差异有统计学意义(Fisher′s精确检验，P=0)。其他耐药基因检出率差异无统计学意义。同时携带4种毒力基因的菌株在ST11菌株中占27.3%(15/55)，高于ST2237菌株中占比0(0/7)，差异无统计学意义(Fisher′s精确检验，P=0.18)。见表3。

表3 不同ST肺炎克雷伯菌耐药基因和毒力基因携带情况

3 讨论

药敏数据显示，临床分离CRKP对头孢他啶/阿维巴坦、黏菌素和替加环素耐药率较低(<1.6%)，其次是米诺环素(43%)；而对氯霉素(78%)、磷霉素(94%)、阿米卡星(97%)耐药率较高；对所有β-内酰胺类检测药物均耐药。这与河南省临床分离CRKP耐药情况一致[18]。携带blaKPC-2、blaDHA或blaCTX-M等基因是造成分离菌株对β-内酰胺类耐药的重要因素。其中，ST2237株对多种β-内酰胺类、四环素类药物及氯霉素的MIC值显著低于ST11株。β-内酰胺类MIC值的升高可能与外排操纵子表达增多、ompK35和ompK36功能缺失或突变以及β-内酰胺酶拷贝数增加有关[19]；ST11在四环素类及磷霉素MIC值的增高可能与其在院内的传播流行及抗菌药物暴露有关。

近年来，高毒力CRKP(hv-CRKP)的报道逐渐增多。Zhang等[20]认为高毒株的界定并不仅仅局限于K1、K2等血清型或其高黏表型，携带iucA、iroN、rmpA和rmpA24种毒力基因的ST11-CRKP在hv-CRKP株中的占比较高(80%)。而这种携带完整毒力质粒pLVPK的菌株在河南省CRKP中占比达37%，其中高毒株检出比例为25.4%[20]。本研究检出的4种毒力基因阳性CRKP占23.8%(15/63)，略低于上述报道数据。其中ST11与ST2237在携带完整pLVPK质粒的检出率上差异无统计学意义。通过查阅临床资料发现，相应感染患者的死亡率亦无差异性。

本院CRKP MLST分型以ST11为主(87.3%)，其次为ST2237(11.1%)。ST11型CRKP在我国大部分区域(包括河南)占主导地位，这与本文研究结果一致。而相比国内其他医院较为多样的ST型[4-5]，本院ST分型种类相对较少，这可能与我院有更为严峻的克隆传播有关。由菌株分离科室分布可见， ST11株分离自呼吸内科、烧伤科、泌尿外科等病区，而ST2237仅分离自急诊ICU和呼吸ICU病区，且分离自呼吸ICU的病患有急诊ICU的转诊经历。进化分析显示ST2237与ST11不在同一进化谱系。本研究样本量偏少，且局限于一所医院。因此，对于ST2237等少见型菌株的流行病学溯源仍需加强监测并增补更多分离菌株验证结论。