新型冠状病毒特异性抗体检测假阳性分析*

巢蓓，范小杰，姚玉华，周寅，史梅，彭阳，周围，马锦洪，史伟峰

(苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州 213003)

2019年底武汉发生原因不明的冠状病毒感染，经基因序列分析发现该病毒与SARS-CoV属同一病毒属，遗传上非常相近，因而国际病毒分类学委员会宣布这种病毒的英文名为“SARS-CoV-2”[1-2]。SARS-CoV-2与2种2018年采集自中国舟山的蝙蝠来源SARS样冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的相似度大于85%，但与SARS-CoV(相似度79%)和MERS-CoV(相似度50%)相差较大[3]。受患者病程、采样质量、检测试剂灵敏度及人员操作的熟练程度等影响，SARS-CoV-2核酸的检出率仅为38%[4]，而血清学抗体具有操作简便、成本低、灵敏度及特异性较好等特点，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》已将抗体检测列入疑似病例确诊或排除的诊断标准之一[5]。鉴于2种检测方法各自特点，应将SARS-CoV-2核酸检测和血清学试验相结合，以提高检出率，降低假阴性和假阳性结果。本研究选取4 825例入院患者，采用化学发光法进行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测，并对抗体阳性患者进行核酸复检，分析抗体检测假阳性的因素，为疫情防控提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2020年3月17日至4月20日本院入院患者共4 825例，其中女性2 653例，男性2 172例，年龄8～92(52±31)岁。采集静脉血3 mL，置于含分离胶的真空采血管内，静置待血液凝固，4 000×g离心5 min，排除脂血、溶血等不合格标本。咽拭子标本由指定人员采集，将拭子折断后置于含有1.5 mL病毒保存液的保存管中，用密封袋包装，置于专用转运箱由专人运送至PCR实验室。静脉血和咽拭子标本均入院即采集。

1.2仪器与试剂 MAGLUMI X8化学发光免疫分析仪(深圳新产业公司)，DA3200核酸提取仪(中山大学达安公司)，ABI 7500 型荧光定量PCR 仪(美国赛默飞公司)；SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体检测试剂盒(深圳新产业公司)，核酸扩增试剂(江苏硕世公司)。

1.3血清IgM和IgG抗体检测 IgM抗体用化学发光免疫捕获法，IgG抗体用化学发光免疫间接法，按试剂盒说明书进行操作。通过光电倍增管检测相对光强度(RLU)，RLU与标本(或校准品/质控品)中SARS-CoV-2 IgM或IgG浓度呈正相关关系，检测结果>1.0 AU/mL为有反应性(阳性)。

1.4RNA 提取和扩增 待测标本56 ℃ 30 min灭活后，按照试剂说明书，在DA3200核酸提取仪上用磁珠法提取。用ABI 7500荧光定量PCR仪进行PCR扩增，FAM通道为开放读码框1ab(ORF1ab)基因，VIC通道为N基因，CY5通道为内标。反应体系共25 μL，包括15 μL反应液、5 μL酶、5 μL核酸提取液。反应参数：50 ℃逆转录10 min；97 ℃预变性1 min；97 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，45个循环。结果判定：FAM和VIC通道同时检测到典型的S型扩增曲线且循环阈值(Ct)≤37，判为阳性；所有通道Ct>40或未检出，判断为阴性；有1个通道结果Ct≤37，其他1个通道检测结果37

2 结果

2.1IgM和IgG抗体检测结果 4 825例血清标本中，有111例IgG抗体阳性[浓度为(4.57±6.53) AU/mL]，4 714例IgG抗体阴性[浓度为(0.36±0.25) AU/mL]；有11例IgM抗体阳性[浓度为(1.32±0.34) AU/mL]，4 814例IgM抗体阴性[浓度为(0.21±0.20) AU/mL]。

11例IgM阳性及111例IgG阳性入院患者均用荧光定量PCR检测咽拭子标本中SARS-CoV-2核酸，结果均为未检出。对检测抗体阳性的患者进行流行病学史调查,均无疫区旅行或居住史，无感染者接触史。临床表现均排除发热和/或呼吸道症状、肺炎影像学特征、发病早期白细胞总数正常或降低、淋巴细胞计数减少中任意2条。均判抗体检测结果为假阳性。IgM抗体假阳性率为0.23%，其中男性0.27%(6/2 172)，女性0.19%(5/2 653)，差异无统计学意义(P>0.05)。而IgG抗体假阳性率为2.30%，其中男性2.62%(57/2 172)，女性2.04%(54/2 653)，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2不同年龄段IgM和IgG抗体假阳性率分析 IgM假阳性率较低，主要分布在51～80岁年龄段。<20岁、21～30岁、31～40岁和41～50岁4个年龄段的患者IgG抗体假阳性率均<1%，各年龄段间差异无统计意义(P>0.05)。随着年龄的增加，IgG抗体假阳性率也逐渐增加。50岁以下患者1 471例，IgG抗体假阳性率为0.75%(11/1 471)；>50岁患者3 354例，IgG抗体假阳性率为2.98%(100/3 354)，>50岁年龄组明显高于<50岁组，差异有统计学意义(χ2=23.63，P<0.001)。见表1。

表1 不同年龄段患者IgM和IgG抗体假阳性结果[n(%)]

2.3不同病种IgM和IgG抗体假阳性率分析 IgM假阳性11例，包括肿瘤2例、糖尿病1例、血液病1例、甲状腺结节1例等。617例肿瘤患者中IgG检出64例，假阳性率为10.37%，包括肺癌13例、乳腺癌13例、胃癌10例、食管癌9例、结直肠癌8例、卵巢癌2例、其他肿瘤9例；呼吸道感染、血液病、慢性肾衰竭、风湿病、脑梗死、骨折等患者的IgG假阳性率分别为5.00%、3.72%、3.01%、1.55%、1.43%、0.68%，见表2。111例IgG假阳性病例中，肿瘤患者占57.66%，血液病患者占10.81%，脑梗死、慢性肾衰和呼吸道感染患者各占3.60%，风湿病和骨折各占2.70%，皮肤病1.80%，其他疾病14.41%。

表2 不同病种IgG抗体检测的假阳性率

3 讨论

SARS-CoV-2 ORF1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因(RdRp)所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制；S区编码棘突蛋白，依赖其与细胞表面血管紧张素转换酶2(ACE2)和丝氨酸蛋白酶TMPRSS2进入宿主细胞；E区编码囊膜蛋白，负责病毒包膜及病毒颗粒的形成；M区编码膜蛋白；N 区编码核壳蛋白，与病毒基因组宿主RNA互相识别[6-8]。由于SARS-CoV-2的RdRp基因在进化树上与 SARS-CoV的RdRp基因显著不同，故被列为一种全新的β属冠状病毒。因而，RdRp基因也成为鉴定SARS-CoV-2核酸的一个重要标志物。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中新型冠状病毒肺炎的实验室诊断依据包括病毒核酸荧光定量PCR检测、全基因组序列同源性分析、IgG及IgM抗体检测[5]。

新型冠状病毒肺炎通常表现为发热、干咳、呼吸困难等肺炎样症状，前期具有隐匿性，其症状与普通感冒相似，部分无症状感染者不易鉴别，给疫情控制带来极大的困难。核酸检测耗时长、操作复杂，假阴性率高达50%。 徐万洲等[9]用化学发光法(深圳亚辉龙公司试剂)检测SARS-CoV-2特异性IgM抗体的敏感性和特异性分别为70.24%和96.2%，而IgG抗体则分别为96.1%和92.41%。免疫层析法IgM/IgG抗体联合检测的敏感性和特异性为88.66%和90.63%[10]，化学发光法具有操作简便、自动化程度高，适用于大批量标本的检测。

本文选择4 825例入院患者，采用化学发光法同时检测其血清IgM抗体和IgG抗体，结果发现11例IgM抗体阳性，111例IgG抗体阳性，IgM、IgG抗体假阳性率分别为0.23%和2.3%。男性、女性IgG抗体假阳性率分别为2.62%和2.04%，差异无统计学意义，说明抗体假阳性与性别无关。<20岁、21～30岁、31～40岁和41～50岁4个年龄段共1 471例患者的IgG抗体假阳性率均<1%，3 354例>50岁患者的IgG抗体假阳性率为2.98%，>50岁年龄组假阳性率高于<50岁组(P<0.001)。提示随着年龄的上升，IgG抗体假阳性率明显升高。推测由于50岁以上的人群患病概率升高，血液中存在治疗药物、类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体、肿瘤细胞等内源性干扰物质，影响抗体的检测。

617例肿瘤患者中IgG检出64例，假阳性率为10.37%；323例血液病患者IgG检出12例，假阳性率为3.72%；193例风湿病患者中检出3例，假阳性率为1.55%。而在111例IgG假阳性病例中，肿瘤、血液病、风湿病分别占57.66%、10.81%和2.7%。肿瘤、血液病患者由于免疫力低下，感染其他冠状病毒的概率高，同时治疗过程中使用化疗药物和其他药物较多，可能对化学发光法检测产生干扰，造成IgG抗体假阳性高。本实验发现1例57岁风湿关节炎患者，类风湿因子(RF) 2 835 IU/L、SARS-CoV-2 IgG抗体2.29 AU/mL；另外1例48岁SLE患者，RF 26.4 IU/L，血清IgG 19.4 g/L，抗Sm抗体、抗着丝点B抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体、抗心磷脂抗体、抗SSA(Ro60)抗体和抗U1-nRNP抗体均阳性，SARS-CoV-2 IgG抗体达45.9 AU/mL。RF主要为IgM类自身抗体，但也有IgG类、IgA类、IgD类和IgE类，具有与变性IgG 产生非特异性结合的特点，可与固相包被的特异性抗体IgG以及随后加入的标记特异性抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。推测自身抗体和RF对检测产生严重干扰。由于条件限制，干扰机制还有待于进一步研究。

研究表明，SARS-CoV-2感染人体5～7 d后产生IgM抗体，10～15 d后产生IgG抗体。由于IgM和IgG抗体出现时间、各种试剂及仪器检测灵敏度及特异性的差异，抗体联合检测虽能提高诊断的灵敏度和特异性，但仍将导致较多的假阴性和假阳性结果[11]。因此，血清或血浆中的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体仅适用于SARS-CoV-2 核酸检测阴性的疑似病例的补充检测，或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用，不能作为新型冠状病毒肺炎确诊及排除依据，不可用于复工复产复学人群或一般人群筛查，否则易导致漏检或造成社会恐慌，给疫情防控带来极大困扰。