碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌多黏菌素耐药性调查及分子机制分析*

张雪，谢小芳，王敏，郑毅，杜鸿

(苏州大学附属第二医院检验科，江苏苏州 215004)

碳青霉烯类药物是治疗肠杆菌科细菌感染，特别是产超广谱β-内酰氨酶(ESBLs)和/或AmpC酶的多重耐药肠杆菌科细菌的一线药物之一[1]。据中国细菌耐药监测网(China Antimicrobial Surveillance Network，CHINET,http://www.chinets.com.)数据显示，肠杆菌科细菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率一直呈上升趋势，分别从2005年的3.1%和2.1%上升至2019年的11.5%和11.4%。而多黏菌素用于治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的应用也越来越多。然而碳青霉烯类和多黏菌素耐药性的共同出现，成为临床治疗难题，使感染控制和管理变得更加困难。

目前，多黏菌素、替加环素以及头孢他啶/阿维巴坦是碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)造成感染的有效治疗药物。在我国，多黏菌素于2017年1月被批准作为注射药物用于治疗细菌感染，并于2017年底被临床采用(http://www.mohrss.gov.cn/gkml/zcfg/gfxwj/201702/t20170223_266775.html)。但多黏菌素作为老药新用，仍存在很多问题。本研究收集3个不同地区2017年1月至12月临床CRE分离株，检测多黏菌素耐药CRE流行状况和耐药机制，为采取合理的用药方案，遏制此类菌株的持续感染和暴发流行提供参考依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2017年1月至12月苏州、成都、北京3个地区临床连续分离的非重复CRE共341株，包括肺炎克雷伯菌218株、大肠埃希菌62株、阴沟肠杆菌31株、弗氏柠檬酸杆菌11株、产气克雷伯菌10株、产酸克雷伯菌5株和黏质沙雷菌4株。根据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2018年更新的指南，亚胺培南、美罗培南和厄他培南最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)>2 μg/mL即为耐药[2]，至少对其中之一耐药的肠杆菌科细菌判定为CRE。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922为本实验室保存菌种。所有菌株经基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)仪鉴定到种。

1.2仪器和试剂 MALDI-TOF MS仪(德国Bruker公司)，Phoenix-100全自动细菌鉴定仪、Phoenix M50自动微生物系统(美国BD公司)，PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)，凝胶成像系统分析仪、实时荧光定量PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)，核酸检测仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，3730xl测序仪(美国ABI公司)；多黏菌素B(美国Sigma公司)，DL2000分子质量标准marker(日本TaKaRa公司)，Trizol试剂(Ambion公司)，第一链cDNA合成试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)，SYBR Green PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)，PCR引物由上海Sangon公司合成。

1.3药敏试验 用欧洲药敏试验委员会(European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)推荐的微量肉汤稀释法检测并判读多黏菌素B的MIC值[3]。对多黏菌素耐药CRE菌株，其他常用临床抗菌药物的体外药敏试验由Phoenix M50自动微生物系统进行评估，并按照2018年CLSI标准，用K-B法复核，并用CLSI指南或EUCAST指南(替加环素)进行解释[2-3]。

1.4多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 使用文献报道的引物序列、反应体系及反应参数，用PCR法扩增多黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌(rpoB、infB、phoE、mhd、pgi、gapA、tonB)[4]、大肠埃希菌(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)[5]和阴沟肠杆菌(rpoB、dnaA、fusA、gyrB、pyrG、rplB、leuS)[6]各自7个管家基因。PCR扩增产物由上海Sangon公司用3730xl测序仪进行Sanger法测序，用Chromas软件分析，测序结果与http//www. mlst.net上公布的相应基因的等位基因序列进行比较，获得该菌株针对7个管家基因的等位基因谱，提交MLST网站，确定临床分离株的序列分型(sequence type，ST)。

1.5多黏菌素耐药基因mcr-1～mcr-9检测 用PCR技术检测多黏菌素耐药CRE菌株中质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1～mcr-9。mcr-1～mcr-8引物序列参考Rebelo等[7]和Borowiak等[8]研究。mcr-9引物根据GenBank中发表的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计，MCR-9F：5′-TTTGATTGCAGGTGTTGCCG-3′，MCR-9R：5′-ACAACCGCCATCGTTCTCTT-3′。反应体系共20 μL，包括5.0 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，PCR mixture 10 μL，ddH2O 6 μL。反应参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。扩增阳性产物由上海Sangon公司用3730xl测序仪进行Sanger法测序，用Chromas软件分析，测序结果与GenBank的原序列进行比对。

1.6多黏菌素耐药调控基因突变检测 用PCR技术对多黏菌素耐药CRE菌株的耐药调控基因pmrA、pmrB、phoP、phoQ、mgrB[9]进行扩增，使用文献报道的引物序列、反应体系及反应参数。PCR扩增产物由上海Sangon公司用3730xl测序仪进行Sanger法测序，用Chromas软件分析，测序结果与GenBank的原序列进行比对，分析突变位点。

1.7实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR) 对多黏菌素耐药CRE菌株，以同期临床分离的多黏菌素敏感CRE菌株为对照，采用RT-qPCR检测多黏菌素耐药调控基因pmrA、pmrC、pmrK和phoQ表达量的变化。根据GenBank中发表的基因序列，通过Primer Premier 5.0设计特异性引物，引物序列见表1。

将菌株在阳离子调节Mueller-Hinton肉汤(CAMHB)中培养至生长对数期，即0.5麦氏浊度单位，采用Trizol法提取细菌总RNA。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，反应体系共20 μL，包括5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLockTMRNA酶抑制剂(20 U/μL)1 μL，10 mmol/L dNTP mixture 2 μL，RevertAidTMM-MuLV逆转录酶(200 U/μL)1 μL，RNA模板1 μL，DEPC水11 μL。反转录条件为：25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。

采用相对定量的方法，以ropB为内参，按照SYBR Green PCR Master Mix操作步骤进行RT-qPCR。每个样品设置3个重复孔，以DEPC水为空白对照模板。反应体系共20 μL，包括1∶10稀释的cDNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，54 ℃退火/延伸，共40个循环；72 ℃开始检测，以0.5 ℃为台阶温度停留5 s采集荧光信号，进行熔解曲线分析。计算相对表达量，目的基因相对表达量= 2-ΔΔCt，其中Ct为阈值循环数，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt= ΔCt实验组-ΔCt对照组。

表1 引物序列

1.8统计学分析 用GraphPad Prism 7.0软件进行。采用非配对t检验和Welch′s correction，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1药敏试验结果 多黏菌素药敏检测结果显示，11株(3.2%，11/341)CRE对多黏菌素耐药。肺炎克雷伯菌耐药率最高(3.7%，8/218)，其次是大肠埃希菌(3.2%，2/62)和阴沟肠杆菌(3.1%，1/32)。

临床常用抗菌药物药敏检测结果显示，多黏菌素耐药菌株对碳青霉烯类药物、头孢菌素、氨曲南、β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合物、喹诺酮类耐药率均较高(>70%)，对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、复方磺胺甲噁唑的耐药率较低，分别为9.1%、36.4%、27.3%、45.4%。见表2。

表2 多黏菌素耐药CRE菌株抗菌药物药敏结果[n(%)]

2.2MLST分型 MLST分型显示，11株多黏菌素耐药CRE菌株中，肺炎克雷伯菌中以ST48型为主(75.0%，6/8)，其次是ST11型(25.0%，2/8)。2株大肠埃希菌分别为ST131型和ST156型，1株阴沟肠杆菌为ST74型。

2.3多黏菌素耐药基因mcr-1～mcr-9检测结果 11株多黏菌素耐药CRE中，检出2株大肠埃希菌携带mcr-1基因，1株阴沟肠杆菌携带mcr-9基因，经测序分析，与GenBank的原序列(MT070410.1和MK070339.1)一致性为100%。8株肺炎克雷伯菌均未检出mcr-1～mcr-9。部分电泳结果见图1。

2.4多黏菌素耐药调控基因检测结果 在1株肺炎克雷伯菌中检出mgrB基因第41个碱基处插入1个反向的ISKpn26，并在两端形成4 bp大小的正向重复序列，见图2。其他基因pmrA、pmrB、pmrC、phoP、phoQ中未检出已知的多黏菌素耐药有关的基因突变。

注：A，mcr-9扩增产物部分电泳分析：1，阴性对照；2，阳性对照；3，待测菌株；M，DL 2000 marker。B，mcr-1扩增产物部分电泳分析：1，待测菌株；3，阴性对照；2，阳性对照；M，DL2000 marker。

图2 mgrB ISKpn26插入序列

2.5实时荧光定量PCR结果 对大肠埃希菌和阴沟肠杆菌外的多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌菌株进行RT-qPCR检测。与同期临床分离的多黏菌素敏感肺炎克雷伯菌株PS1相比，8株多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的pmrA、pmrC、pmrK、phoQ基因表达水平均明显上调(P<0.01)，见图3。

注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

3 讨论

多项研究报道了在CRE中检测到多黏菌素耐药，并与其他耐药基因(blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-9、blaKPC-2、blaKPC-3、blaOXA-48、blaOXA-181)共存[10]。本研究通过对苏州、成都、北京3个地区的341株CRE菌株进行药敏试验，发现在没有使用多黏菌素的情况下，有3.2%的CRE已经对多黏菌素耐药，且对临床常用大多数抗菌药物高度耐药(>70%)，提示在临床实践中应警惕这些已经存在的多黏菌素耐药菌株，避免其进一步传播。

目前，肠杆菌科对多黏菌素耐药主要分为染色体和质粒介导的耐药机制。最近研究发现质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr已通过水平转移传播到各种生态系统，包括水、土壤、植物、动物和公共场所。mcr-1是第一个被报道的质粒携带的多黏菌素耐药基因，通过修饰脂多糖上脂质A的4′-磷酸乙醇胺介导对黏菌素的耐药[11]。本研究在2株大肠埃希菌中检测到mcr-1基因，其多黏菌素的MIC值为8 μg/mL，解释了其对多黏菌素耐药的机制。

随后发现了一系列mcr基因，例如mcr-1.2～mcr-1.13、mcr-2～mcr-2.9和mcr-3～mcr-9。有研究表明，mcr-9基因编码磷酸乙醇胺转移酶，与其他已知的质粒编码的MCR(MCR-1～ MCR-8)具有33%～65%的同源性。MCR-9功能与MCR-1类似，即在脂质A中加入磷酸乙醇胺基团，对脂多糖的结构进行修饰，在自然状态下对多黏菌素敏感性影响较小，在多黏菌素的诱导下可产生高水平的耐药[12]。另一项研究表明mcr-9在大肠埃希菌中可导致MIC值较低的多黏菌素耐药[13]。本研究中1株阴沟肠杆菌中携带mcr-9基因，其MIC值为4 μg/mL，且未发现与多黏菌素耐药有关的突变，mcr-9可能为该菌株对多黏菌素耐药的机制。

染色体介导的耐药机制由phoPQ和pmrAB双组分系统调控，该系统可响应低镁浓度和其他环境刺激(包括暴露于多黏菌素)，使4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N，由pmrHFIJKLM-ugd调控)和/或磷酸乙醇胺(pEtN，由pmrC调控)对脂质A进行修饰，减少细菌表面的阴离子电荷，导致多黏菌素与细菌外膜的静电结合减少。肠杆菌科细菌主要通过破坏涉及双组分系统的基因，使细菌获得多黏菌素耐药性。MgrB是一种小的跨膜蛋白质，对PhoPQ具有负反馈调节作用。mgrB中插入序列或突变会导致MgrB蛋白失活，消除对PhoP/PhoQ调节系统的负反馈，并导致多黏菌素耐药[14]。本研究检测到1株肺炎克雷伯菌存在mgrB的插入，进一步RT-qPCR结果显示，8株多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的pmrA、pmrC、pmrK、phoQ基因表达水平都明显上调(P<0.01)，包括7株未发现上述mcr基因以及已知耐药调控基因突变的菌株，表明这些菌株可能由于上调pmrCAB和pmrHFIJKLM操纵子的表达，导致发生脂多糖修饰，从而导致多黏菌素耐药。

未使用多黏菌素的患者出现多黏菌素耐药的机制仍不清楚，在非克隆传播的情况下，可能由于质粒介导的多黏菌素耐药性水平传播。氯己定是医院常用的消毒剂，有研究表明暴露于氯己定可导致脂多糖修饰以及相关膜蛋白表达的改变，从而导致多黏菌素耐药[15]。此外，编码ESBLs或碳青霉烯酶的基因转座可破坏mgrB基因，从而导致对多黏菌素耐药。食用动物中的耐药菌也可通过食物链传播到人类[16]。

本研究由于收集的菌株数量有限，尚不能完全反映多黏菌素耐药CRE的流行情况和耐药机制。但从以上数据可以得出，即使在未使用多黏菌素的情况下，仍有3.2%的CRE对多黏菌素耐药，其机制主要与染色体和质粒介导有关。提示临床随着多黏菌素的应用，多黏菌素耐药菌株可能会被筛选并传播，因此应加强细菌耐药监测和抗菌药物管理，延缓多黏菌素耐药性的发展，为抗菌药物的疗效和安全性提供保障。