抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体在狼疮抗凝物阳性患者中的危险预测价值*

褚雅歆，林博之，张云聪，郭晗，乔蕊

(1.北京大学第三医院检验科，北京100191；2.北京大学国际医院检验科，北京102206)

抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS)是一种持续携带抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)的自身免疫病。根据2006年修订的APS分类标准[1]，诊断APS需要至少满足1个实验室标准和1个临床标准。满足实验室标准是指抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody，aCL)、抗β2糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2 glycoprotein Ⅰ antibody，aβ2GPⅠ)和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)3种aPL至少有1项检测阳性[2]；临床标准指的是发生APS相关的临床事件：血栓栓塞事件(thromboembolism，TE)和不良妊娠结局(adverse pregnancy outcomes，APO)等。其中,LA是诊断APS的功能试验，是判断APS危险度最好的抗体，与TE和APO的关系密切[3]。尽管如此，仍有为数不少的LA阳性患者并不发生TE或APO，因此需要与临床事件相关性更好的指标辅助aPL谱进行危险度判断。抗磷酯酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体(anti-phosphatidylserine/prothrombin complex antibodies，aPS/PT)是一种磷脂结合蛋白抗体，是导致LA阳性的抗体之一，与LA具有良好的一致性，有研究认为aPS/PT可作为LA的替代实验[4]。目前，可通过包被有磷脂酰丝氨酸/凝血酶原(phosphatidylserine/prothrombin,PS/PT)抗原的微孔板检测aPS/PT。研究发现，aPS/PT与血栓事件的发生具有强相关性[5-6]，且研究提出aPS/PT是最有价值纳入APS诊断的aPL谱的新型aPL[7-10]。本课题旨在研究aPS/PT对LA阳性患者发生临床事件的危险预测价值。

1 对象和方法

1.1研究对象 连续入选北京大学第三医院2018年1月至2019年9月2次及2次以上LA检测阳性的患者，且每次检测间隔12周及以上，共167例，年龄(33.4±6.3)岁，其中女性157例，男性10例。由于老年人LA假阳性率较高，因此排除年龄≥70周岁者。收集入选病例的临床数据，并根据APS的分类标准[1]将研究对象分为TE组、APO组、TE+APO组：TE定义为任何组织或器官的动脉、静脉或小血管的一次或多次临床栓塞事件；APO定义为以下几个方面：<10周无法解释的自发性流产，伴有母体激素水平异常；或无法解释的≥10周发育正常胎儿死亡；或由于胎盘机能不全导致早产，新生儿<34周。对于LA检测阳性但没有以上相关事件发生的病例在本研究中定义为LA携带者。

1.2标本采集与检测

1.2.1血液采集与处理 针对LA检测，用枸橼酸钠抗凝管采集患者血液，充分混匀，2 000×g离心15 min，2 h内收集乏血小板血浆(poor platelet plasma，PPP)，-80 ℃储存备用；针对其他aPL的检测，用血清分离管采集患者血液，2 000×g离心10 min，2 h内收集血清，-80 ℃储存备用。

1.2.2aPL检测 LA检测：国际血栓与止血学会(ISTH)指南推荐至少选择2种磷脂依赖的凝固时间试验检测LA。用LA1试剂(德国Siemens公司)进行稀释蝰蛇毒试验(dilute Russell′s viper venom time，dRVVT)和用Automated APTT试剂(爱尔兰Trinity Biotech公司)进行以硅土作为激活剂的凝血试验(silica clotting time，SCT)以检测LA。2种实验均在ACL TOP®自动凝血分析仪(西班牙Werfen公司)上进行。2种实验中任意1种阳性即为LA阳性。根据试剂盒说明书，dRVVT或SCT的标准化比值分别高于1.11或1.16即为LA阳性。

aCL和aβ2GPⅠ检测：血清aCL(IgG，IgM，IgA)和aβ2GPⅠ(IgG，IgM，IgA)的检测均通过 BIO-FLASH化学免疫分析仪及其配套QUANTA Flash®试剂盒(西班牙Werfen公司)以化学免疫分析法进行。根据说明书，抗体的截断值为20 CU，抗体的任意亚型阳性即代表该抗体阳性。

血清aPS/PT检测：血清aPS/PT检测用BIO-FLASH 化学免疫分析仪(西班牙Werfen公司)及QUANTA Lite®酶联免疫吸附试剂盒(美国INOVA Diagnostics公司)进行，根据说明书，aPS/PT(IgG和IgM)的截断值为30 units。

1.3统计学分析 用SPSS 23.0软件进行统计学分析，用GraphPad Prism 7.0软件绘图。抗体阳性率比较采用卡方检验；不同组间抗体浓度水平的比较采用Mann-WhitneyU检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床事件发生情况 167例研究对象中，有18例(10.8%)发生TE事件，91例(54.5%)发生APO事件，6例(3.6%)既发生TE又合并有APO事件，共52例(31.1%)LA抗体阳性但未发生临床事件(LA携带者)。

2.2aPS/PT阳性率及浓度情况 不同临床表现的LA阳性患者的aPS/PT阳性率情况见表1。发生临床事件的LA阳性患者(TE组，APO组和TE+APO组，即所有事件组)的aPS/PT IgG阳性率(37.4%)高于LA携带者组(9.6%)，差异有统计学意义(P<0.05)；而所有事件组aPS/PT IgM阳性率(53.0%)与LA携带者组(38.5%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)；所有事件组的aPS/PT IgG和IgM同时阳性的发生率(31.3%)高于LA携带者组(5.8%)，差异有统计学意义(P均<0.05)。

进一步比较发现，aPS/PT IgG阳性率在TE组(55.6%)、APO组(29.7%)以及TE+APO组(100.0%)均高于LA携带者组(9.6%)，差异均有统计学意义(P均<0.05)。TE+APO组aPS/PT IgM的阳性率(100.0%)高于LA携带者组(38.5%)，差异有统计学意义(P<0.05)；而TE组(55.6%)、APO组(49.5%)aPS/PT IgM的阳性率与LA携带者组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；aPS/PT IgG和IgM同时阳性率在TE组(44.4%)、APO组(24.2%)以及TE+APO组(100.0%)均高于LA携带者组(5.8%)，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表1 不同临床表现的LA阳性患者的aPS/PT阳性率

不同临床表现的LA阳性患者的aPS/PT浓度情况见图1。aPS/PT IgG浓度在所有事件组高于LA携带者组，(49.2±5.2)units vs(20.1±3.4)units，P=0.001 6(见图1A)。aPS/PT IgM浓度在所有事件组高于LA携带者组，(63.0±5.8)units vs(46.6±7.9)units，但差异无统计学意义(见图1B)。

aPS/PT IgG浓度在TE+APO组[(125.7±40.3)units]、TE组[(76.3±61.4)units]和APO组[(40.9±50.2)units]高于LA携带者组[(38.6±22.1)units]，差异均有统计学意义，P值分别为<0.001、<0.001和0.018 9(见图1C)。aPS/PT IgM浓度在TE+APO组[(116.3±40.0)units]和TE组[(91.2±59.7)units]高于LA携带者组[(46.5±52.1)units]，差异均有统计学意义，P值分别为0.005 1和0.041 4；而APO组[(54.6±51.3)units]与LA携带者组[(46.5±52.1)units]，差异无统计学意义，P>0.05(见图1D)。

2.3aPL谱阳性率及aPS/PT在aPL谱的浓度情况 167例研究对象中有61例表现为只有LA阳性(LA单阳)，66例表现为3种抗体阳性(全阳)。aPL谱在不同临床事件的阳性率情况见表2。通过比较aPL谱在临床事件中的阳性率情况，发现aPS/PT阳性组与全阳组相似，一致性检验显示二者一致性系数Kappa为0.114，P=0.012；将aPS/PT组分别与LA单阳组和双阳组进行比较，Kappa一致性系数为0.057和0.012，P值分别为0.287和0.810。

注：A、B分别为所有事件组与LA携带者组IgG型、IgM型aPS/PT的浓度情况；C、D分别为不同事件组和LA携带者组的IgG型、IgM型aPS/PT浓度情况；#，P>0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

表2 不同临床表现LA阳性患者的aPL谱阳性率[n(%)]

IgG型aPS/PT抗体浓度在三阳组[(64.6±62.8)units]高于LA单阳组[(19.7±16.7)units]，P<0.001(见图2A)。IgM型aPS/PT抗体浓度在三阳组[(84.3±51.8)units]高于LA单阳组[(29.3±40.8)units]，P<0.001(见图2B)。

注：A、B，IgG、IgM型aPS/PT浓度在不同aPL阳性组合中的浓度情况；#，P>0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

3 讨论

aPS/PT是一种磷脂结合蛋白抗体，并没有被纳入APS实验室诊断的抗体检测。但大量研究表明aPS/PT在APS患者中表现为高阳性率，且与LA具有强相关性，是引起LA阳性的原因之一，有潜力作为LA的替代实验进行实验室检测[11-12]。研究表明,aPS/PT是血栓栓塞(不论是动脉血栓或静脉血栓)的预测指标[13]。本研究针对纳入的LA阳性患者分析aPS/PT阳性率及浓度，评估了aPS/PT在LA阳性患者中的临床事件危险预测价值。

首先，本研究根据是否发生临床事件对LA阳性患者进行分组，发现aPS/PT IgG在所有事件组(TE组、APO组以及TE+APO组)的阳性率和浓度高于其在LA携带者组的阳性率和浓度，IgM在所有事件组中的阳性率和浓度高于LA携带者组，但差异无统计学意义，提示与aPS/PT阴性组的患者相比，在aPS/PT阳性时发生临床事件的可能性增高、危险度增大，且IgG型抗体与临床事件的相关性优于IgM型。另外分析LA携带者组内的aPS/PT阳性率情况，发现aPS/PT IgM阳性率高于IgG型，也提示了IgG型aPS/PT相较IgM型具有更高的致病性。因此，针对LA阳性患者且aPS/PT阳性的患者，在临床管理方面需要采取预防措施，对于aPS/PT阳性的患者尤其是IgG阳性的患者要采取干预措施以预防临床危险事件的发生。其次，进一步分析每一种事件与LA携带者组的差异，发现aPS/PT IgG阳性率在TE+APO组、TE组以及APO组均高于LA携带者组，其浓度在TE+APO组、TE组和APO组均高于LA携带者组；不同于IgG、IgM的阳性率仅在TE+APO组与LA携带者组间有差异，其浓度在TE+APO组与LA携带者间有差异，提示aPS/PT阳性的患者发生TE或APO的风险增加，且aPS/PT IgG型抗体与TE或APO事件的相关性优于IgM型，进一步确证aPS/PT IgG型抗体阳性发生临床事件危险度高于IgM型。文献研究提示，在体内凝血因子Ⅴa和Ⅹa存在的条件下，aPS/PT能够促进凝血酶的生成及凝血酶原与磷脂的结合，从而促进更多的凝血酶生成[14]。aPS/PT促进凝血酶生成的作用可能是aPS/PT与APS中TE发生具有很强关联性的原因[12，15]，这使aPS/PT有潜力作为提示APS患者发生TE的良好关联指标。既往研究认为，不论是对于动脉血栓或静脉血栓，aPS/PT与TE具有良好的相关性[5]，且aPS/PT与TE的相关性以及检测的敏感性均高于aPS和aPT[1，9，3-4]。除了TE，本研究也提示aPS/PT阳性与APO事件具有一定相关性，但本研究并未对TE组与APO组的aPS/PT的差异进行比较。虽然针对aPS/PT与APO的相关性研究甚少，目前针对aPS/PT在APO中的机制尚未完全阐明，但有2种潜在的机制值得被深入探究：其一，在妊娠过程中胎盘滋养层细胞外表面暴露大量磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)，在aPS/PT的存在下，胎盘微血管循环中会产生大量血栓，导致胎盘发育不全以及胎儿丢失；其二，在小鼠体内，凝血酶原在胎鼠发育过程中具有重要作用，aPS/PT的存在会导致小鼠体内缺乏凝血酶原，进而导致胚胎死亡。

限于某些患者aPL谱中抗体阳性但并不发生临床事件的局限性，以及单独aPL谱评估APS发生临床事件风险不充足，因此迫切需要具有良好临床事件相关性的抗体辅助aPL谱对临床事件的风险进行整体评估。目前aPL谱危险度划分定义LA阳性为高危，即本研究纳入的研究对象均为高危人群，但通过比较aPS/PT与aPL谱不同组合的一致性发现，aPS/PT阳性组与aPL谱的三阳组具有一致性且aPS/PT浓度在三阳组高于另外两组，说明aPL谱中三阳组相较于LA单阳组和双阳组发生临床事件的危险度更高，是高危aPL谱中发生临床事件可能性最大的aPL谱，针对aPL谱三阳组以及aPS/PT同时阳性的人群应做好预防。

以上结果提示LA阳性患者在aPS/PT阳性情况下发生临床事件的危险增高，且IgG与临床事件相关度优于IgM，aPL谱中三阳组与aPS/PT具有一致性且发生临床事件危险度最高。

本次研究也有不足之处：纳入研究对象主要为女性患者居多，可能导致结果存在偏倚；针对aPS/PT辅助aPL谱对患者进行危险分层仍需要样本量更大、多中心及前瞻性的研究。