TGF-β/SMAD4信号通路中基因突变对胰腺癌患者生存的影响

方闯，田伟军

（天津医科大学总医院普通外科，天津300052）

在近几十年中胰腺癌的发病率及死亡率都在持续上升，预计到2030年胰腺癌将成为美国第二位肿瘤相关的死因[1-2]。在中国2015年癌症相关死亡人数约有2 814 000人，平均超过7 500人/年，其中胰腺癌的发病率呈逐年升高的趋势且其成为癌症相关死亡的前10位肿瘤[3]。胰腺癌诊断较为困难，其早期缺乏特定的症状和体征，超过80%的患者在确诊时已经是不可切除或有远处转移[4]。90%的胰腺癌为导管腺癌，其对现有的放疗和化疗不敏感，从而使得其5年生存率小于8%。转化生长因子（TGF）-β信号通路在胰腺导管腺癌中具有正向调节肿瘤生长的作用，SMAD4蛋白作为此信号通路中关键的分子，在此通路功能中具有较为重要的作用。

随着生物技术的进步和基因高通量检测的发展，DNA微阵列技术和二代检测技术的应用使得个体化基因检测成为了可能。研究证实胰腺癌包含多基因和多靶点的突变，这使得胰腺癌患者之间存在较大的异质性，相同的化疗方案在不同患者间的整体收益相差较大。本研究进行了胰腺导管腺癌患者基因突变的NGS测序，并同时回顾性总结了其临床资料，分析了TGF-β/SMAD4信号通路上关键位点基因突变的情况，探究了SMAD4基因突变对患者生存的影响，以期为一部分胰腺导管腺癌患者的临床预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2016年7月1日-2019年9月1日天津医科大学总医院收治，术后病理确诊为胰腺导管腺癌的患者19例，随访资料完整，最后回访截止日期为2019年9月1日。患者临床获取病理时记为生存起始时间，主要及次要终点事件分别为患者死亡与随访结束。收集患者的临床特征、血液学检查、肿瘤分期及存活时间等。

1.2 方法 手术中留取胰腺肿瘤患者新鲜肿瘤组织样本2份，将其分别浸泡于10%中性福尔马林溶液中。第一份先行病理诊断，待病理诊断结果返回后，将病理诊断为胰腺导管腺癌的患者的第二份肿瘤组织样本行基因检测。收集医院病理回报为胰腺导管腺癌的患者的基因突变情况和随访的临床数据。访问dbSNP及COSMIC数据库，对TGF-β/SMAD4信号通路上的基因突变的情况及临床意义进行总结。

1.3 统计学处理 本组数据采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，取α=0.05为检验水准。采用Kaplan-Meier生存分析法和对数秩和检验分析，率的比较采用χ2检验，单因素分析采用Log-Rank检验。

2 结果

2.1 一般临床特征 19例胰腺导管腺癌患者的一般临床资料如表1所示。

2.2 基因检测结果 利用NGS技术对19例胰腺导管腺癌患者的组织标本进行360个基因的测序，结果显示：19例患者中共出现63个基因突变和115个变异位点。19例胰腺导管腺癌患者的基因突变检测结果如图1所示：最常见的突变基因是KRAS（84.2%）、TP53（68.4%）、SMAD4（26.3%）、CDKN2A（26.3%）、CREBBP（15.8%）、RNF43（15.8%）、BRAF（15.8%）等。

表1 胰腺导管腺癌患者的临床资料Tab 1 Clinical characteristics of patients with pancreatic cancer

图1 19例患者63个基因的115个位点的突变热图Fig 1 Mutant heat maps of 115 loci in 63 genes of 19 patients

19例胰腺导管腺癌患者中具有TGF-β/SMAD4信号通路（SMAD4/SMAD3/TGFBR1/TGFBR2）相关基因突变的患者有7例（36.8%），5例患者具有SMAD4基因突变（2例为内含子位点的突变），其中SMAD4基因突变患者中有2例患者同时具有TGFBR1基因的突变；1例患者具有SMAD3基因突变，1例患者具有TGFBR2基因突变，详见表2，其余患者未检测到此通路相关的基因突变。

表2 TGF-β/SMAD4信号通路中各基因突变情况Tab 2 Gene mutations in TGF-β/SMAD4 signaling pathway

19例胰腺导管腺癌患者中，此信号通路中基因突变的类型包括错义突变（6例）、剪切突变（2例）和无义突变（1例），各基因突变丰度在8.03%～46.30%且各不相同。各基因突变位点的临床意义包括致病与潜在致病。

2.3 生存分析 19例患者随访截至2019年9月1日，死亡10例（52.6%），存活9例（47.4%）。中位总生存期（median overall survival，mOS）为 14.0个月（95%CI：3.4～24.6）。将具有SMAD4基因突变的患者记为SMAD4基因突变组，无SMAD4基因突变患者记为无SMAD4基因突变组，其他各基因突变的生存分析依次进行。

患者突变基因特征与其生存的关系显示，SMAD4基因突变组中位生存时间5.0个月，无SMAD4基因突变组中位生存时间14.0个月，差异有统计学意义（χ2=4.583，P=0.032），见图 2。其他生存分析显示以KRAS基因突变分组、TP53基因突变分组及CDKN2A基因突变分组所得的生存分析均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

胰腺导管腺癌是致死性较高的疾病，在过去几十年里其临床治疗均未取得实质性进展，一线标准化疗方案中吉西他滨联合白蛋白紫杉醇OS为8.5个月，FOLIRNOX方案的OS为10.2个月[5-6]。近期研究表明胰腺导管腺癌基因突变具有复杂性，一方面，在胰腺导管腺癌的发生、发展中具有高频的突变基因，例如KRAS、TP53等，另一方面，它具有大量的中低频突变基因，例如SMAD4、ATM、FANCG等[7-9]。胰腺导管腺癌中KRAS基因突变频率为70%～95%，TP53基因突变为75%，SMAD4基因突变为50%[10-12]，大致与本研究中各基因突变频率相近。针对KRAS、TP53、CDKN2A等高频突变基因的研究，其临床治疗应用收益甚微[13-15]。因此，能否通过研究及治疗具有SMAD4基因突变的患者来提高胰腺导管腺癌的整体生存率成为了未来胰腺导管腺癌治疗的可能方向之一。

图2 SMAD4基因突变组与无SMAD4基因突变组生存分析Fig 2 Survival analysis of SMAD4 mutant group and no SMAD4 mutant group

TGF-β/SMAD4信号通路在肿瘤组织中起到了一个复杂的双向作用。在肿瘤早期，TGF-β/SMAD4信号通路负向调节肿瘤生长，而在肿瘤进展期或晚期，则正向调节肿瘤生长。胰腺导管腺癌SMAD4基因变异使得SMAD4蛋白活性减低，必然导致TGF-β信号通路遭到破坏，从而失去对肿瘤细胞增殖的抑制作用。本研究中具有SMAD4基因突变的患者相较于SMAD4基因未突变的患者具有更差的生存预后，这也进一步说明SMAD4基因突变具有促进胰腺导管腺癌进展的作用。SMAD4蛋白是介导TGF-β信号从细胞浆进入到细胞核的关键分子[16]。在胰腺导管腺癌中，SMAD4基因缺失可以使得KRAS诱导的癌症过程加速[17]，并且SMAD4蛋白随着胰腺癌分化程度的降低而减少[18]。SMAD4蛋白表达的减少预示着胰腺导管腺癌患者更差的预后[19]。而有研究表明SMAD4蛋白表达缺失的可切除胰腺导管腺癌患者相对于SMAD4蛋白正常表达的可切除胰腺导管腺癌患者行术后辅助治疗后，前者具有更高的局部和远处转移率，而生存率却没有统计学差异[20]，此可能为SMAD4蛋白是基因转入与翻译后的产物，其受到多种途径的调节。本研究为胰腺导管腺癌患者基因层面与生存分析的结果，可为胰腺导管腺癌提供临床预后评估指标，为新的靶向治疗提供参考靶点。

5例SMAD4基因突变的患者中存在2例TGFBR1基因突变的患者，他们分别仅存活2个月及5个月，前者TGFBR1S241L基因突变丰度较高（45.13%），后者TGFBR1N338I基因突变丰度较低（8.03%）。同时具有2个TGF-β/SMAD4信号通路中关键基因突变的患者临床预后比此通路中单基因突变患者的生存较差，且生存时间与基因突变丰度有一定关系。

本研究仅为单中心胰腺导管腺癌患者的临床及基因突变的分析及报道，通过临床资料汇总，对高频突变基因及TGF-β/SMAD4信号通路上基因突变做了初步分析，有待进一步行多中心、大样本、RNA及蛋白表达层面的验证。

TGF-β/SMAD4信号通路中具有SMAD4基因突变患者的临床预后相较于无基因突变患者的临床预后更差。此通路中具有SMAD4基因突变的患者同时发生TGFBR1基因突变的生存时间较短且其基因突变丰度较高。本研究为胰腺导管腺癌患者的临床预后提供参考，为胰腺导管腺癌靶向治疗提供新的参考靶点。