Nrf2促进肝癌细胞的迁移与侵袭能力

张宁，赵秀兰，李勇莉，董学易，赵楠，刘铁菊

（天津医科大学基础医学院病理学教研室，天津300070）

肝癌是全球导致死亡的第四大恶性肿瘤，由于早期症状不明显，预后普遍很差[1]。目前肝癌手术治疗及靶向治疗效果均不佳[2]。肝癌的高侵袭性及高转移性为治疗带来极大困难[3]。核转录因子Nrf2是CNC（Cap′n′Collar）转录因子家族成员，具有高度保守的碱性区亮氨酸拉链结构bZip（basic regionleucine zipper）[4]。Nrf2在调控细胞氧化应激、增殖、分化及凋亡等多种细胞功能中发挥重要作用[5]。有研究表明，Nrf2在多种恶性肿瘤中呈高表达[6]，并且与肿瘤细胞侵袭及转移等多种生物学行为密切相关[7]。目前Nrf2与肝癌发生、发展的机制尚未明确，与肝癌迁移侵袭关系研究又甚少。研究Nrf2与肝癌迁移侵袭之间的关系能够为肝癌的诊断、治疗及预后提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 所用的人肝癌细胞系Bel-7402购于美国ATCC公司，HCC-LM3购于北京协和细胞库，293T购于上海复旦大学中山附属医院。

1.1.2 实验试剂 DMEM培养基、RPMI-1640培养基、Opti-MEM培养基均购自美国Neuronbc公司，FBS（胎牛血清）购自美国Gibco公司。质粒与慢病毒包装试剂盒均购自美国GeneCopoeia公司，质粒包括 NFE2L2过表达质粒（EX-T3128-Lv201），NFE2L2过表达对照质粒（EX-NEG-Lv201）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HCC-LM3在含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基中培养，Bel-7402细胞使用含10%FBS、1%双抗的RPMI-1640培养基。细胞均在37℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 293T在10%灭活血清DMEM培养基中培养48 h后，根据慢病毒包装说明书，将质粒转染进293T细胞，48 h后收集病毒液，Bel-7402、HCC-LM3在10%灭活血清培养基中培养24 h后，病毒液与培养基以1:1比例加入培养皿中，48 h后在荧光显微镜下观察转染效率，并加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞。

1.2.3 Western印迹 细胞裂解提取蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白，PVDF膜转膜90 min，5%脱脂奶粉/TBST室温封闭1 h，加入抗体Nrf2 （1:1 000）、GAPDH （1:2 000）、MMP 2（1:500）、MMP9（1:500）后 4℃过夜，转天恢复室温后洗膜，加入二抗室温摇床2 h，洗膜后加入发光液，显影照相。应用Image J软件分析蛋白条带。

1.2.4 划痕实验 六孔板中培养细胞，24 h后细胞融合度达到100%，使用中枪头在每个孔正中轻划一道线，洗掉漂浮细胞后加入含5%FBS的DMEM培养基，于0、24、48 h在倒置显微镜下照相，观察细胞的迁移程度并记录。

1.2.5 细胞侵袭实验 侵袭实验提前将Matrigel胶与DMEM培养基1:8比例混合，添加20 μL在Transwell小室，于细胞培养箱过夜；24孔板内添加500 μL含10%FBS的培养基，上室添加200 μL无血清培养基制成的细胞悬液，细胞数目为1×105个/mL，细胞培养箱培养48 h后取下小室，甲醇固定，结晶紫染色，倒置显微镜下观察并计数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料分析采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Nrf2对肝癌细胞迁移运动能力的影响 划痕实验结果显示：与对照组相比，过表达Nrf2质粒的HCC-LM3细胞在48 h时间点，伤口愈合速度增强（t=4.435，P＜0.05），在72 h时间点迁移速度也较对照组显著增加（t=37.11，P＜0.05）；同样，过表达 Nrf2质粒的Bel-7402肝癌细胞在24 h时间点，与对照组比较，迁移速度明显增加（t=11.17，P＜0.05），48 h时间点伤口愈合速度也较对照组增加（t=10.43，P＜0.05），见图 1。

2.2 Nrf2对肝癌细胞侵袭能力的影响 采用Transwell侵袭实验评价Nrf2对肝癌细胞侵袭能力的影响。结果显示：在过表达Nrf2的HCC-LM3肝癌细胞中，与对照组相比，穿过基质胶及滤膜的细胞数目增加（t=3.945，P＜0.05）；同样在过表达 Nrf2的Bel-7402肝癌细胞中，穿过基质胶及滤膜的细胞数目较对照组明显增多（t=13.51，P＜0.05），见图 2。

2.3 Nrf2表达对肝癌细胞MMP2及MMP9表达的影响 进一步通过Western印迹检测转染Nrf2质粒后的HCC-LM3与Bel-7402肝癌细胞中与转移侵袭相关蛋白的表达情况。结果发现：在过表达Nrf2的HCC-LM3细胞中，MMP2及MMP9表达量均增加（t=2.879，P＜0.05；t=5.582，P＜0.05）；同样，在过表达Nrf2的Bel-7402细胞中，MMP2及MMP9的表达量也相对增加（t=3.756，P＜0.05；t=2.968，P＜0.05），见图 3。

图1 过表达Nrf2对肝癌细胞迁移能力的影响Fig 1 Effects of Nrf2 on the migration in HCC-LM3 and Bel-7402 cells

2.4 Nrf2表达对肝癌患者生存时间的影响 对GEPIA数据库中具有临床资料的400例肝癌患者进行Kaplan-Meier生存分析，结果发现：Nrf2高表达肝癌患者的平均生存时间短于Nrf2低表达的肝癌患者（Logrank P=0.042），见图 4。

图2 Nrf2对肝癌细胞侵袭能力的影响Fig 2 EffectsofNrf2ontheinvasioninHCC-LM3andBel-7402cells

图3 肝癌细胞Nrf2过表达后MMP2及MMP9的表达变化Fig 3 Expression of MMP9 in HCC-LM3 and Ble-7402 cells after transfection with overexpression plasmid of Nrf2

图4 Nrf2的表达与肝癌患者生存时间的关系Fig 4 Relationship between the expression of Nrf2 and survival time of patients with hepatocellular carcinoma

3 讨论

中国肝癌发生率居世界前列，全球范围内中国有约一半的原发性肝癌病例，原发性肝癌包括肝细胞肝癌、胆管细胞肝癌、混合型肝癌及纤维板层样肝癌，其中肝细胞肝癌占90%以上[8]。随着医疗水平的进步，近年来肝癌诊断率得到增加，但临床资料发现肝癌5年生存率并没有明显提高，这与肝癌容易发生侵袭、转移有关。肝癌转移使患者失去手术根治机会，放化疗后容易复发，死亡率极高[9-10]。研究与肝癌转移相关的分子靶点对肝癌诊断与干预具有临床指导意义。

Nrf2在多种恶性肿瘤中呈高表达，研究表明Nrf2在肿瘤发生、发展中发挥重要作用[11]。大量实验证明，Nrf2通过调控多种信号途径参与肿瘤增殖、侵袭及转移等多种行为。例如Nrf2通过调控Notch1信号转导途径，促进肝癌迁移侵袭能力[12]。在乳腺癌中，Nrf2通过结合雌激素受体相关受体（estrogen receptor-related receptor 1,ERR1）基因启动子序列，抑制ERR1基因的转录，从而减少RhoA蛋白降解，RhoA能够增强乳腺癌细胞的迁移侵袭及增殖能力[13]。Nrf2也能抑制肿瘤细胞E-cadherin表达，同时上调N-cadherin表达，促使肿瘤细胞丧失上皮特性向间质细胞转化，肿瘤侵袭转移能力也随之增加[14]。Nrf2基因敲除能够抑制小鼠脑血管内皮细胞的迁移及增殖[15]。Nrf2能够启动p62基因的转录，并形成正反馈共同促进肿瘤细胞的发生发展[16]。此外，恶性肿瘤中如肝癌[17]、肺癌[18]、乳腺癌[19]等Nrf2高表达提示患者预后较差，并且Nrf2表达增加能作为肿瘤患者的独立预后因素。本研究中，迁移和侵袭实验均表明Nrf2过表达促进了人肝癌细胞系在体外迁移运动及侵袭能力，提示Nrf2表达可能在肝癌侵袭转移进展中发挥重要作用，进一步对公共数据库400例肝癌患者临床资料进行分析发现，Nrf2高表达的肝癌患者生存时间普遍短于Nrf2低表达的肝癌患者，说明Nrf2表达与肝癌患者预后具有相关性。

肿瘤细胞发生迁移侵袭离不开细胞外基质及血管基底膜的蛋白降解，MMP是一种细胞外基质的锌依赖性蛋白水解酶，在癌症侵袭转移过程发挥关键作用[20]。MMP2与MMP9均是MMP家族中的重要成员，在机体中参与新生血管生成、组织修复等过程[21]。研究表明，多种恶性肿瘤如肝癌[22]、乳腺癌[23]、黑色素瘤[24]等能通过增加MMP2及MMP9外分泌促进肿瘤迁移及侵袭能力。MMP2与MMP9表达不仅参与肿瘤的侵袭转移过程，也与恶性肿瘤患者的低生存率密切相关[25-26]。有学者发现，Nrf2通过调控其下游靶基因血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）的转录，间接诱导MMP2表达增加，从而进一步促进恶性肿瘤的迁移侵袭能力[27]。在肝癌与胶质瘤中，Nrf2表达促进MMP2或MMP9的表达水平，从而促进肿瘤细胞的迁移及侵袭[28-29]。Nrf2基因敲除后发现食管癌细胞中MMP2的表达随之降低，而E-cadherin表达增加，Nrf2通过促进食管癌细胞MMP2表达促使肿瘤细胞发生上皮间质转化，进一步增加癌症侵袭性[30]。本实验通过Western印迹证明Nrf2表达上调后肝癌细胞中MMP2与MMP9蛋白表达均显著增加，其迁移侵袭能力明显增加，提示Nrf2很可能通过调控MMP2与MMP9的表达，进而促进肿瘤的迁移侵袭过程。

Nrf2作为家族中最重要的转录因子，其在肿瘤中发挥的作用尤为重要。本研究通过体外细胞实验探讨Nrf2与肝癌细胞迁移侵袭的关系，证明Nrf2通过调控MMP2与MMP9表达促进了肝癌细胞迁移侵袭能力，并对网络公共数据库进行挖掘发现Nrf2可能与肝癌患者的不良预后相关，但Nrf2如何调控MMP的表达尚需更进一步的研究。本实验分析了Nrf2在体外肝癌细胞迁移侵袭中的作用机制，为肝癌在转移侵袭等生物学功能的研究及治疗提供了新的见解与方向。