长链非编码RNA-FENDRR在膀胱癌组织中的表达及临床意义

王玉杰，沈冲，高深，达拉，胡海龙

（天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

膀胱癌（bladder cancer,BCa）是全球第十大最常见肿瘤，我国第七大男性恶性肿瘤，2018年全球预计约549 000新发病例，200 000死亡病例，欧美国家或地区膀胱癌发病率呈逐年上升趋势，国内情况也类似，国家癌症中心最新数据显示我国膀胱癌年发病人数62 000人，发病率8.83/10万[1-2]。膀胱癌有高复发率和容易进展等流行病学特征，因此需要长期监测与随访，但目前尚未找到理想的肿瘤抗原相关的瘤标，所以有必要进一步研究膀胱癌的发病机制，探索对膀胱癌早期诊断、治疗与预后评价更敏感更有效的生物标志物[3-4]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度大于200 个核苷酸的转录本[5]，在表观遗传[6]、转录[7]及转录后[8]多个水平调控基因表达，通过多种方式激活促癌基因亦或沉默抑癌基因，参与肿瘤的发生、进展及转移等过程。LncRNA-FENDRR，全称是FOXF1邻近非编码发育调控RNA，是一种新颖的长链非编码RNA，来源于16号染色体，转录本长度为960 nt。近年来的研究证实lncRNA-FENDRR在肺癌[9]、乳腺癌[10]、胃癌[11]、肝癌[12]和胆管癌[13]等多种肿瘤中异常表达，广泛涉及细胞增殖、侵袭、转移、凋亡或耐药等多方面调控。在泌尿生殖肿瘤中，目前已有研究报道lncRNA-FENDRR低表达与肾细胞癌[14]和前列腺癌[15]患者预后不良相关；在前列腺癌中通过lncRNA-FENDRR/miR-18a-5p/RUNX1轴调节细胞增殖和凋亡等生物过程[15]。综上说明lncRNA-FENDRR可能是很有前景的新型生物标志物，或有望成为癌症治疗的新靶点。但是目前只有很少研究报道lncRNA-FENDRR在膀胱癌中的临床及预后意义，所以本研究将对膀胱癌中lncRNA-FENDRR的表达水平及其与临床特征及患者预后情况等相关性进行研究，为膀胱癌诊断与治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月—2019年5月在天津医科大学第二医院泌尿外科治疗并进行手术切除的50例膀胱尿路上皮癌患者的癌组织及其癌旁正常组织标本，其中男44例，女6例；年龄49～85岁，平均 67.4岁；分期 Ta～T1 24 例，T2～T4 26 例，淋巴转移阳性23例；肿瘤直径0.5～5.5 cm，中位数2.65 cm；吸烟者29例。所有入组患者术前均未接受放化疗等辅助治疗，术中取距离肿瘤边缘＞5 cm的膀胱正常黏膜作为癌旁正常组织为对照组，术后均经病理学检查证实。癌及癌旁组织采集后立即浸入液氮快速降温，储存于-80℃冰箱中以备用。记录入选患者的性别、年龄、分期、分级、肿瘤数目及大小等临床病理特征。本研究经天津医科大学第二医院伦理委员会审核并批准，所有入组患者或其直系亲属术前均已同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 人膀胱上皮永生化细胞株SV-HUC-1购自上海酶研生物科技有限公司，膀胱癌细胞系中T24、5637和EJ由天津市泌尿外科研究所提供，253J-BV由西安交通大学第一附属医院泌尿外科李磊教授馈赠。RNA提取试剂Trizol购买自美国Invitrogen公司，组织总RNA提取试剂盒购买自美国Omega bio-tek公司，cDNA合成试剂盒、实时荧光定量PCR试剂购买自瑞士Roche公司。LncRNA-FENDRR以及内参GAPDH引物均通过Primer Premier 6.0引物设计软件设计，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。LncRNA-FENDRR上游引物：5′-ACTGTCAAAACCAGCTCTGCC-3′，下游引物：5′-TGGCCTCTTGCCTTGGTTTTT-3′；GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3′，下游引物：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取、文库制备以及全转录组高通量测序 选取5例T2期及以上的膀胱癌及癌旁正常组织标本进行全转录组高通量测序（上海云序生物科技有限公司提供技术服务）。采用Trizol法提取组织标本的总RNA，NanoDrop ND-1000仪（Thermo Fisher Scientific,美国）测定RNA浓度、纯度（A260/A280），后者在1.8～2.0之间合格；变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性以及有无gDNA污染。构建去rRNA链的特异性文库，用BioAnalyzer 2100仪器（Agilent Technologies，美国）进行质控和定量后，用Illumina HiSeq 4000（PE150）上机测序。

1.3.2 生物信息学分析 经过测序获得双端reads，利用Q30进行质控，用cutadapt软件（v1.9.3）去掉低质量reads，获得高质量reads，将后者与人类参考基因组（UCSC HG19）对比。在gtf基因注释文件指导下，使用cufflinks软件（v2.2.1）获得mRNA和lncRNA的FPKM值，计算两组样品间的fold change和P值。fold change＞2或＜-2，且P＜0.05被认为是lncRNA的表达有显著差异。根据临近关系，预测lncRNA的靶基因，进行GO和KEGG通路分析。

1.3.3 细胞培养 4种膀胱癌细胞系均在含10%胎牛血清、青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育；SVHUC-1细胞用F-12K培养基培养，其他条件同前；处于对数生长期的细胞用于下游实验。

1.3.4 细胞和组织的RNA提取 qRT-PCR按照组织总RNA提纯试剂盒说明书步骤操作，采用过柱法提纯组织和细胞总RNA，经超微量可见分光光度计检测，A260/A280在1.8～2.0视为纯度合格。采用两步法将总RNA逆转录为cDNA，条件设置为65℃10 min 预变性；25℃ 10 min，55℃ 30 min，85℃5 min，-20℃保存。qRT-PCR采用3步法，扩增参数：95℃ 5min 预热；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，扩增45个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA表达的相对定量，每例组织或每种细胞设置3个复孔，求均值。

1.3.5 随访 本研究中对入选患者进行定期随访，至少每3个月随访1次，主要包括院内复查、电话或短信等方式。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0对本实验所有数据进行分析及作图，计量资料用x±s表示，计数资料比较使用χ2检验，两组比较使用t检验。lncRNA-FENDRR表达水平与患者临床病理特征的相关性采用χ2检验或Fisher精确概率计算法（双侧）。Kaplan-Meier法绘制不同亚组的术后生存曲线，用Log-rank检验比较两组之间的生存率有无差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 差异lncRNA表达谱及其生物信息学分析 以P＜0.05、变化倍数＞2.0为标准，共筛选出103个差异表达lncRNA，其中上调36个，下调67个（图1）。分别列举上调和下调的前10个（表1）。对差异lncRNA进行GO功能分析，上调部分集中于组蛋白多种表观遗传修饰、细胞凋亡过程的调控等生物过程，常染色质等细胞组分和组蛋白结合等分子功能；下调部分集中于cAMP介导的信号转导、mRNA剪接点选择、调控G蛋白耦联受体信号通路、Ras信号通路、p53介导的内在凋亡信号通路等多条信号通路、黏附连接等细胞组分和泛素蛋白连接酶活性、蛋白激酶结合等分子功能。对差异lncRNA进行KEGG通路分析，结果主要集中在化学性致癌作用和黏附连接等。

图1 差异表达lncRNA的聚类分析图Fig 1 The heatmap of differentially expressed lncRNAs

表1 膀胱癌中差异表达lncRNA的TOP10Tab 1 Top10 of differentially expressed lncRNAs in bladder cancer

2.2 lncRNA靶标筛选与验证 从差异lncRNA表达谱中选择了明显上调（miR205HG）和显著下调（FENDRR、CARMN、PART1、MEG3）的共 5 个 lncRNA作为靶标，在预实验中，笔者在24例BCa组织验证上述靶标的表达水平（图2），结果发现PART1和MEG3组织验证结果与测序结果相悖，针对剩余3个靶标进行文献复习，发现FENDRR是一个比较新颖的长链非编码RNA，在膀胱癌中鲜有研究，综合考虑后，本研究选择lncRNA-FENDRR作为研究对象。

图2 靶标组织验证结果Fig 2 The expression level of targets in BCa tissues

2.3 lncRNA-FENDRR在膀胱癌组织和细胞中表达水平 在50例膀胱癌组织中验证lncRNAFENDRR表达水平，总体水平上lncRNA-FENDRR在膀胱癌组织中明显下调（图3A）；lncRNA-FENDRR在癌组织中的相对表达量为0.431±0.564，显著低于癌旁组织 1.007±0.014，差异有统计学意义（t=7.222，P＜0.000 1）（图 3B）。与 SV-HUC-1 相比，在 T24、EJ、5637和253J-BV等膀胱癌细胞系中lncRNAFENDRR显著下调，其中5637相对表达量最低，差异有统计学意义（P＜0.000 1）（图 3C）。

2.4 lncRNA-FENDRR与患者临床特征的相关性 以膀胱癌组织中lncRNA-FENDRR相对表达量的上四分位数（P75）为截断值，将lncRNAFENDRR表达量分为高表达组（12例）和低表达组（38例）。相关性分析发现，lncRNA-FENDRR表达水平与肿瘤浸润深度相关（P=0.047 5），而与其他临床特征无关（表2）。

图3 lncRNA-FENDRR在组织和细胞系的表达水平Fig 3 The expression level of lncRNA-FENDRR in BCa tissues and cell lines

2.5 lncRNA-FENDRR与膀胱癌患者临床预后的关系 定义入组患者因膀胱癌死亡为主要终点事件，入组患者最长随访时间为21.8个月，中位随访时间10.3个月。Kaplan-Meier生存曲线显示，lncRNAFENDRR低表达组肿瘤特异性生存率（tumor specific survival rate，TSS）低于高表达组（HR=3.17，95%CI：1.37～7.32），亚组之间TSS差异具有统计学意义（Log-rankP=0.030 8）（图 4）。

表2 lncRNA-FENDRR表达水平与膀胱癌患者临床病理特征的相关性Tab 2 The relationship between expression level of lncRNA-FENDRR and clinical characteristics of patients with BCa

图4 lncRNA-FENDRR不同表达组的肿瘤特异性生存率Fig 4 The TSS of the patients with low and high expression of lncRNA-FENDRR

3 讨论

迄今为止，膀胱癌患者治疗策略的制定与预后的评估是基于其临床和病理指标，但这些方法的主要缺点是在某些情况下肿瘤呈现相似的组织学特征，但是对相同治疗方案的反应也不同，患者的预后情况也不尽一致[16-17]。因此，应将常规方法和分子生物标志物相结合，可改善这些患者的临床结局[18]。随着癌症基因组学的发展，揭示了lncRNA不仅可以作为肿瘤的新治疗靶点，还可以作为早期诊断与复发和预测肿瘤患者预后的生物标志物。研究发现，在非肌层浸润性膀胱癌中，HOTAIR[19]、UNMIBC[20]与肿瘤复发和患者不良预后相关；Li等[21]发现MALAT1表达上调与患者不良预后有关，表明MALAT1可能是预测膀胱癌患者预后的独立生物标志物。

本研究前期通过测序获得膀胱癌组织中lncR NA差异表达谱，从中选择了显著上调或下调的5个lncRNA作为候选靶标，经预实验中组织验证，最终选择lncRNA-FENDRR作为研究对象。近年来研究发现，lncRNA-FENDRR在多种癌症中均显著下调。本研究在50例膀胱癌组织中验证发现（图3A、3B），总体水平上，lncRNA-FENDRR在BCa组织中也是显著下调的；同时在4种膀胱癌细胞系中验证，结果一致。研究表明，在非小细胞性肺癌[9]和胃癌[11]中lncRNA-FENDRR表达水平与浸润深度显著相关；而且在胃癌[11]、肾细胞癌[14]和前列腺癌[15]中也证实，lncRNA-FENDRR的低表达与患者不良预后相关。本研究以膀胱癌组织中lncRNA-FENDRR表达量的上四分位数为截断值，将其分为低表达组和高表达组，通过χ2检验对患者临床资料进行相关性分析（表2），结果发现lncRNA-FENDRR表达水平与浸润深度显著相关，提示lncRNA-FENDRR可能参与膀胱癌从低分期到高分期的进展过程。经过随访，结果发现lncRNA-FENDRR低表达组BCa患者的TSS明显低于高表达组患者，差异具有统计学意义，提示在膀胱癌中lncRNA-FENDRR低表达预示着BCa患者的预后不良。但本研究的局限性在于纳入病例不足，随访时间较短，这对结果有一定的影响。综上所述，提示lncRNA-FENDRR可能参与膀胱癌进展过程，而且lncRNA-FENDRR低表达与BCa患者不良预后有关，但是否是膀胱癌预后的独立预测因子需要更多研究证实。

lncRNA-FENDRR在膀胱癌组织和细胞系中均显著下调；lncRNA-FENDRR表达水平与浸润深度有关；随访发现lncRNA-FENDRR低表达组患者的TSS更低，即lncRNA-FENDRR低表达与患者不良预后相关，lncRNA-FENDRR可能是预测膀胱癌预后的潜在生物标志物，有待更多研究证实。