定量分析肠道菌群失衡与肝硬化病情的关系*

唐源淋 陈 烨

深圳市第三人民医院消化内科1(518114) 南方医科大学南方医院消化内科 广东省胃肠疾病重点实验室2

背景：肝硬化发病率在我国逐年上升，尤其是失代偿期肝硬化及其相关并发症严重威胁国人健康。目的：研究肝硬化患者的肠道菌群改变及其与病情严重程度和预后的关系。方法：纳入2010年12月—2011年7月南方医科大学南方医院收治的肝硬化患者100例和50名健康人，提取粪便标本基因组DNA，采用菌属特异性引物行real-time PCR定量检测，分析肠道菌群改变与肝功能分级、预后评分、炎症指标以及肝硬化并发症的相关性。结果：与对照组相比，肝硬化组粪便中肠杆菌属数量显著增加，乳酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属数量显著减少(P均<0.05)。肠杆菌属数量与肝功能分级、Child-Turcotte-Pugh(CTP)评分、终末期肝病模型(MELD)评分、C反应蛋白(CRP)和自发性腹膜炎呈显著正相关(P均<0.05)，梭菌属则与上述指标呈显著负相关(P均<0.05)。结论：在肝硬化患者中，肠道菌群失衡(肠杆菌属数量增加、梭菌属数量减少)与病情严重程度和预后有一定相关性。菌群失衡可能通过促进炎症反应参与肝硬化进展。

肝硬化是我国常见病，发病率逐年上升，尤其是失代偿期肝硬化及其相关并发症严重威胁国人健康。失代偿期肝硬化患者常死于感染、上消化道出血、肝性脑病等并发症。在人体与微生物的交互作用中，肠-肝轴居关键地位[1]。动物实验显示，肠道菌群失衡在大鼠肝硬化模型并发症的发生、发展中起重要作用[2-3]。目前关于肝硬化患者肠道菌群的临床研究较少，对发生紊乱的菌群及其对患者预后的影响尚不明确。本研究以健康人作为对照，分析肝硬化患者的肠道菌群改变及其与病情严重程度和预后的关系。

材料与方法

一、研究对象

研究纳入2010年12月—2011年7月南方医科大学南方医院消化内科和感染内科收治的肝硬化患者100例，入选者均为肝炎后肝硬化，男性88例，女性12例，平均年龄(52±13)岁；肝功能Child-Pugh分级A级50例，B级31例，C级19例。纳入标准：①经临床表现、组织形态学和影像学检查确诊，符合肝硬化诊断标准；②病历资料完整。排除标准：①合并严重心、脑、肺、肾等器官功能不全(不包括肝肾综合征、肝肺综合征、肝性脑病)；②合并功能性消化不良、慢性腹泻、炎症性肠病等已知可引起肠道菌群紊乱的胃肠道疾病；③有胃肠道手术史。50例对照者为同期南方医院体检中心经常规检查无异常发现的健康成人，男性36例，女性14例，平均年龄(53±12)岁。两组间性别构成、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

二、方法

1. 标本采集：标本采集前4周内所有受检者均未使用抗菌药物和微生态制剂。于排便后2 h内将粪便标本收集于密闭的粪便储存盒内。外周血标本5 mL收集于促凝采血管中，平衡后室温离心3 500 r/min×5 min，血清分离后分装。上述标本迅速储存于-80 ℃低温冰箱中。

2. 粪便基因组DNA提取：使用TIANamp粪便DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]。每例受检者称取20 mg粪便样本，按试剂盒说明书提取基因组DNA，-20 ℃保存。

3. PCR引物设计：根据文献报道设计肠杆菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属的菌属特异性引物[4-5]，使用BLAST数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对引物序列特异性(表1)。

4. PCR引物特异性检测：提取健康成人粪便基因组DNA进行PCR扩增。反应体系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，总体积25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(温度见表1)，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物凝胶电泳分析未见明显非特异性扩增，提示各菌属引物特异性良好。

表1 菌属特异性PCR引物

5. Real-time PCR：使用天根生化科技(北京)有限公司的real-time PCR试剂盒。将质粒标准品连续10倍稀释，获得10～107系列拷贝数标准品，以之为模板构建标准曲线。反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL，总体积20 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，退火20 s(肠杆菌属58 ℃，肠球菌属52 ℃，乳酸杆菌属58 ℃，拟杆菌属60 ℃，梭菌属60 ℃)，72 ℃ 30 s，45个循环。反应结束后分析熔解曲线。将待测粪便DNA适当稀释，反应体系和反应条件同上，行real-time PCR扩增。检测重复3次，结果取均值。

三、统计学分析

应用SPSS 13.0统计学软件，计量资料以M(P25,P75)表示，两组间比较采用两独立样本非参数检验中的Mann-Whitney U检验，多组间比较采用多个独立样本非参数检验中的Kruskal-Wallis H检验；率的比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、肝硬化患者肠道菌群改变

与对照组相比，肝硬化组粪便中肠杆菌属数量增加，乳酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属数量减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，肠球菌属数量无明显变化(P>0.05；表2)。将肠杆菌属、肠球菌属数量高于对照组中位值和乳酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属数量低于对照组中位值定义为肠道菌群异常，肝硬化组肠杆菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属正常与异常者的比例分别为28/72、60/40、33/67、25/75和27/73，其中肠杆菌属、拟杆菌属、梭菌属异常者占比高于对照组，差异有统计学意义(P=0.006;P=0.007;P=0.003)。

表2 肝硬化组与对照组肠道菌群比较[M(P25, P75), lg copies/g湿粪]

二、肠道菌群与肝硬化严重程度和预后的关系

除乳酸杆菌属外，其余四种菌属在不同肝功能分级肝硬化患者中的数量分布差异均有统计学意义(P<0.05；表3)。相关性分析显示，肠杆菌属数量与Child-Pugh分级、Child-Turcotte-Pugh(CTP)评分、终末期肝病模型(MELD)评分和血清C反应蛋白(CRP)水平呈显著正相关(P=0.022;P=0.044;P=0.043;P=0.021)；肠球菌属与前三个指标呈显著正相关(P=0.012;P=0.005;P=0.017)；梭菌属与四个指标均呈显著负相关(P<0.001;P<0.001;P=0.007;P=0.003)；拟杆菌属只与Child-Pugh分级呈显著负相关(P=0.011)；乳酸杆菌属与四个指标均无相关性(P>0.05；表4)。

表3 不同肝功能分级肝硬化患者肠道菌群比较[M(P25, P75), lg copies/g湿粪]

表4 肠道菌群与肝硬化严重程度和预后的关系(秩相关系数rs)

三、肠道菌群与肝硬化并发症的关系

相关性分析显示，肝硬化并发症与肠道菌群失衡之间有一定关联，肠杆菌属、肠球菌属数量与自发性腹膜炎的发生呈显著正相关(P<0.05)，梭菌属数量则与之呈负相关(P<0.05)；肠球菌属数量与腹水发生呈显著正相关(P<0.05)；乳酸杆菌属、拟杆菌属数量与肝硬化并发症无相关性(P>0.05；表5)。

表5 肠道菌群与肝硬化并发症的关系

讨 论

人体肠道内有近1014个微生物，分属于500～1 000个不同种类[6]，包括细菌、真菌、病毒等。肠道细菌包括需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌，以厌氧菌为主，主要有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门等，前两种菌门占肠道细菌总量的70%以上，是肠道微生物的重要组成部分。在肠道微生物与宿主相互适应的过程中，微生物、宿主与肠道微环境之间达到一种平衡，此种平衡状态对人体生理活动和健康发挥至关重要的作用。肠道内、外环境的改变导致优势菌群减少，进而引起肠道菌群失衡/紊乱，过路菌或条件致病菌数量超出正常水平致疾病发生。现已发现肥胖[7]、炎症性肠病[8]、肠易激综合征[9]、2型糖尿病[10]、代谢综合征[11]、非酒精性脂肪性肝病[3,12]等多种疾病与肠道菌群失衡有关，且不断有证据表明肠道菌群在肝硬化及其并发症的发生、发展中起重要作用[3]。

本研究应用real-time PCR技术定量检测肝硬化患者的粪便菌群改变，结果提示患者存在不同程度的肠道菌群失衡，表现为肠杆菌属数量显著增加，乳酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属数量显著减少，肠杆菌属、拟杆菌属、梭菌属菌群异常者占比显著增高。肠杆菌属数量随肝功能的恶化而逐步增加，并与提示预后的MELD评分、炎症指标CRP以及肝硬化并发症自发性腹膜炎的发生呈显著正相关；拟杆菌属、梭菌属数量则随肝功能的恶化而减少，其中梭菌属与MELD评分、CRP和自发性腹膜炎呈显著负相关。上述发现提示肝硬化患者的肠道菌群失衡，尤其是肠杆菌属、拟杆菌属和梭菌属的变化与肝硬化病情和预后之间有密切联系，临床上应予充分重视。国、内外其他关于肠道菌群与肝硬化的研究亦得出与本研究大致或部分相符的结果[13-16]，如钟转华[15]的研究发现肝硬化患者的肠道菌群失衡表现为双歧杆菌、乳酸杆菌等有益厌氧菌减少，肠杆菌、葡萄球菌、梭菌增加，且上述菌群变化可随肝功能好转而恢复；Chen等[14]和Kakiyama等[16]也报道了肝硬化患者肠道中条件致病菌肠杆菌显著增加。Lata等[17]的随机对照试验中，肝硬化患者的基线肠道菌群失衡严重程度与肝硬化病因无关, 而与肝功能分级相关。这些研究结果均表明肠道菌群失衡与肝硬化患者的病情严重程度和预后有密切联系，可加速疾病进展。

本研究发现肝硬化患者肠道梭菌属数量显著减少，且与病情和预后呈负相关。Qin等[13]的宏基因组学研究也证实了这一变化，但亦有肝硬化患者肠道梭菌数量增加的报道[15]。梭菌属是肠道内的优势厌氧菌，包含梭杆菌、梭球菌、艰难梭菌等众多细菌。其中艰难梭菌是一种可致伪膜性肠炎的致病菌，梭杆菌则可酵解结肠中不消化的碳水化合物，产生短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)[18]。SCFAs不仅能为结肠细胞供能，而且对维持肠道细胞的完整性以及分泌和免疫功能具有重要意义，可加强肠黏膜屏障功能。本研究结果提示肠道梭菌属对肝硬化患者有一定保护作用，梭菌属中可能存在一些有益菌种，但尚需进一步研究验证。

目前研究认为肠道微环境改变是肝硬化患者发生肠道菌群失衡的机制之一。肝硬化时肠道黏膜充血水肿，营养状况差，菌群营养底物缺乏；次级胆汁酸和分泌型IgA(sIgA)减少，胆汁中含有可抑制肠道细菌过度生长的多种抗体和非特异性抗黏附素成分，并能中和细菌内毒素，因此肝硬化时肠腔内胆汁减少不利于肠道菌群的平衡[16]；肠蠕动减慢，清除能力降低，导致肠道细菌过度生长[19]。上述因素使维持肠道微生态平衡的宿主因素受到破坏，最终导致菌群失衡。肠道菌群失衡后，革兰阴性杆菌产生大量内毒素，通过损伤的肠屏障进入体循环，形成内毒素血症，激活肝脏Kupffer细胞，释放大量促炎细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，使肝损害持续，进一步恶化肝功能，严重影响患者预后[20]。CRP是反映机体炎症状态的重要指标，本研究分析显示肝硬化患者的肠杆菌属和梭菌属数量与血清CRP水平显著相关，进一步提示了菌群失衡可能通过促进炎症反应在肝硬化进展过程中发挥作用。

综上所述，肠道菌群失衡在肝硬化及其并发症的发生、发展中起重要作用，与病情严重程度和预后有一定相关性。患者出现肠道菌群紊乱、肠黏膜通透性增加，提示肝损伤严重，预后可能较差。因此，在临床工作中，检测肝硬化患者的肠道菌群和肠黏膜通透性对病情评估和改善预后具有重要意义。尤其值得关注的肠道菌群包括肠杆菌属、拟杆菌属和梭菌属，对上述菌群进行更深入的研究，可能为研发新的益生菌制剂提供理论依据。微生态制剂干预是阻断肝硬化肠道菌群失衡的关键，但相关制剂种类繁多，目前研究未能提供充分的循证医学证据支持何种益生菌制剂更有效及其临床使用的适宜周期，需扩大样本量、延长随访时间作进一步研究。不同种类的微生态制剂作用机制不同，不同病因肝硬化治疗过程中益生菌的选择亦不确定，因此微生态制剂菌种的筛选亟待加强。这一工作需要更细致的菌群分析结果，这也对肝硬化患者肠道菌群的定量分析提出了更高的要求，是未来肠道微生态研究的重要方向之一。