结肠肌间神经丛随增龄的形态学变化研究

张倩倩 郑松柏

复旦大学附属华东医院消化内科(200040)

背景：老年人胃肠动力障碍性疾病高发，可能与肠肌间神经丛(MP)的老化有关。目的：探讨不同月龄大鼠结肠MP的形态结构随增龄的变化。方法：将14只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按年龄分为6、18和25月龄组，以HE染色测定MP及其神经元的形态学变化，免疫组化染色检测蛋白基因产物9.5(PGP9.5)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和c-kit免疫阳性细胞的数量。结果：三组大鼠MP内神经节面积(H=8.14，P=0.02)、神经节密度(F=4.12, P=0.046)、神经元胞体面积(F=9.60，P=0.00)、神经元胞核面积(H=9.29，P=0.01)、每个神经节内神经元数量(F=7.60，P=0.01)以及PGP9.5阳性神经元数量(F=26.11，P=0.00)、AChE阳性神经元数量(H=11.83，P=0.00)、nNOS阳性神经元数量(F=20.77，P=0.00)、c-kit阳性细胞数量(F=14.25，P=0.00)相比差异有统计学意义。与6月龄组相比，18月龄组、25月龄组神经节面积、神经元胞体面积、神经元胞核面积显著升高(P<0.05)，而神经节密度、每个神经节内神经元数量、PGP9.5阳性神经元数量、AChE阳性神经元数量、nNOS阳性神经元数量、c-kit阳性细胞数量显著降低(P<0.05)。结论：随着增龄，MP存在明显的衰老(或称退化)和代偿现象，这可能与老年人胃肠动力减退、胃肠动力障碍性疾病高发有密切关系。

老年人功能性消化不良、慢性便秘等胃肠动力障碍性疾病高发[1-4]，但其机制尚不明确，可能与消化道肌间神经丛(myenteric plexus, MP)随增龄而发生衰老等因素有关[5-7]。MP是肠神经系统(enteric nervous system, ENS)的重要组成部分，其神经元通过兴奋性神经递质(如乙酰胆碱、P物质和5-羟色胺)和抑制性神经递质(如一氧化氮、血管活性肠肽和生长抑素等)调节消化道运动功能。因此，MP退化可能是老年人胃肠道动力低下的重要原因。本研究通过对不同月龄的大鼠结肠MP内神经节和神经元形态以及蛋白基因产物9.5(PGP9.5)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和c-kit免疫阳性细胞的数量进行分析，旨在探讨MP随增龄变化的特点及其与肠道运动功能的关系，从一个侧面了解老年人胃肠动力障碍性疾病的发生机制。

材料与方法

一、实验动物

选取4只6月龄(体质量472.40～521.30 g)、5只18月龄(体质量632.30～687.50 g)和5只25月龄(体质量702.50～750.00 g)SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[合格证号：SCXK(沪)2017-0005]，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。按照网站https://www.taletn.com/rats/age/，将不同月龄大鼠的年龄换算成人类年龄，分别为18岁、45岁和62岁。大鼠自由进食、饮水，饲养于温度为(24±2) ℃、相对湿度为50%±5%的环境中，自然光照，12 h明暗周期，适应性饲养1周后用于后续实验研究。实验过程中对动物的处置均符合动物伦理学标准。

二、研究方法

1. 标本获取：所有动物在取材前1 d 20∶00后禁食、禁水，取材当天称重后，采用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，剖腹，以肛门为起点，于距肛门8.0 cm处(相当于乙状结肠和直肠交界部位)取全层肠段1.0 cm。

2. HE染色：将肠段置于4%甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，连续切片。行HE染色，二甲苯脱蜡，中性树脂封片。由2名病理科医师在光学显微镜下观察并拍照，测量神经节和神经元形态学指标：①应用Image J软件在200倍镜下测量标本长度，手动勾勒出神经节轮廓，测量神经节面积；②在400倍镜下逐一计数MP中神经节数量，计算神经节密度(神经节密度=标本中神经节数量/标本长度)；③在400倍镜下，每张切片选择10～20个切面完整的神经元，应用Image J软件手动勾勒出神经元及其细胞核轮廓，测量并记录神经元及其细胞核的面积[8-9]。

3. 免疫组化染色：将石蜡切片常规脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶活性、封闭，滴加一抗兔抗鼠PGP9.5(购自Abcam，以1∶1 000稀释)、兔抗鼠AChE(购自Diagbio，以1∶20稀释)、兔抗鼠nNOS(购自Abcam，以1∶500稀释)、兔抗鼠c-kit单克隆抗体[购自爱必信(上海)生物科技有限公司，以1∶200稀释]4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，滴加二抗室温孵育，DAB显色，苏木素染核，脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。

结果判断：PGP9.5、AChE和nNOS均定位于细胞质，以MP中细胞质呈棕黄色的细胞为阳性；c-kit定位于细胞质和质膜，以内环肌和外纵肌之间细胞质和(或)质膜呈棕黄色的细胞为阳性。两名病理科医师在高倍镜下(×400)观察，每张切片随机选择10个神经节，计数每个神经节内PGP9.5免疫阳性神经元数量；每张切片随机选择5个不重叠视野，计数内环肌与外纵肌之间PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit阳性细胞数量并记录均值。

三、统计学分析

结 果

一、神经节、神经元和神经纤维的形态学增龄变化

三组大鼠结肠壁内环肌和外纵肌间均可见MP及其神经节，6月龄大鼠神经节面积小，数量多，其内神经元数量多，神经元胞质呈粉红色，胞核呈紫蓝色。18月龄和25月龄大鼠神经节面积增大，神经元数量减少，神经元胞体和胞核染色较6月龄浅，胞核面积增大。三组大鼠神经纤维均呈淡粉色，相互交织成网，6月龄组神经纤维排列整齐、致密，18月龄组略疏松，25月龄组神经纤维排列杂乱、扭曲(图1A-1I)。

二、神经节面积和神经节密度的增龄变化

三组MP内神经节面积相比差异有统计学意义(H=8.14，P=0.02)，且18月龄组和25月龄组显著高于6月龄组(P=0.01，P=0.01)，而25月龄组与18月龄组相比差异无统计学意义；三组神经节密度相比差异有统计学意义(F=4.12，P=0.046)，其中25月龄组较6月龄组显著下降(P=0.02)，其余各组间相比差异均无统计学意义(表1)。

三、神经元面积和数量的增龄变化

三组神经元胞体面积相比差异有统计学意义(F=9.60，P=0.00)，其中18月龄组和25月龄组显著高于6月龄组(P=0.02，P=0.01)，而18月龄组和25月龄组相比差异无统计学意义；三组神经元胞核面积相比差异有统计学意义(H=9.29，P=0.01)，其中18月龄组和25月龄组显著高于6月龄组(P=0.01，P=0.01)，而18月龄组和25月龄组相比差异无统计学意义；三组每个神经节内神经元数量相比差异有统计学意义(F=7.60，P=0.01)，其中18月龄组和25月龄组显著低于6月龄组(P=0.01，P=0.00)，而18月龄组与25月龄组相比差异无统计学意义(表1)。

表1 三组大鼠神经节和神经元形态学增龄变化

四、MP内PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit阳性细胞数量的增龄变化

免疫组化染色可见阳性细胞呈棕黄色，灶状分布于内环肌和外纵肌之间，胞体大小不等，形态多样，细胞核呈蓝色。三组间PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit阳性细胞数量相比差异均有统计学意义(F=26.11，P=0.00；H=11.83，P=0.00；F=20.77，P=0.00；F=14.25，P=0.00)。两两比较发现，18月龄组和25月龄组MP内PGP9.5阳性神经元均较6月龄组显著减少(P=0.00，P=0.00)，18月龄组与25月龄组相比差异无统计学意义；18月龄组和25月龄组MP内AChE阳性神经元数量较6月龄组显著减少(P=0.01，P=0.01)，25月龄组又显著低于18月龄组(P=0.00)；18月龄组和25月龄组MP内nNOS阳性神经元数量较6月龄组显著降低(P=0.00，P=0.00)，而18月龄组与25月龄组相比差异无统计学意义；18月龄组和25月龄组c-kit阳性细胞较6月龄组显著减少(P=0.00，P=0.00)，而18月龄组与25月龄组相比差异无统计学意义(图2A-2L、表2)。

表2 各组大鼠PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit阳性细胞数量的增龄变化

A-C：PGP9.5；D-F：AChE；G-I：nNOS；J-L：c-kit

讨 论

肠道平滑肌受ENS和外来神经(迷走神经和脊神经)支配，其中ENS起主导作用[10]。ENS由黏膜下神经丛和MP组成，MP内神经元通过分泌神经递质可直接调节肠道运动。肠腔内的化学信号和机械信号经迷走神经传入纤维和脊神经传入纤维分别传导至脑干背侧孤束核和脊髓背角，通过上行神经传导束投射至大脑皮质，大脑皮质接收信号后经迷走神经和脊神经传导至MP，从而调节肠道平滑肌的运动。此外，ENS可通过蠕动反射独立调节肠道运动。

老龄是肠道动力障碍的重要危险因素之一。老年人反流性食管炎、慢性便秘和功能性消化不良等疾病的患病率显著高于中青年人[6,11]。60岁以上老年人功能性消化不良患病率达11.30%[3]，84岁及以上老年人慢性便秘患病率可达20.00%～37.30%[4]。乙状结肠与直肠交界处是MP随增龄退化最为显著的部位[12-13]。因此，本研究选择距肛门8 cm处的肠段(相当于乙状结肠与直肠交界部位)为标本，探讨MP随增龄的变化。

Sun等[14]的研究以蛋白质印迹法和免疫荧光法对2、16和20月龄C57BL/6J小鼠结肠MP神经元进行定量分析发现，20月龄组神经元数量显著低于2和16月龄组。Bernard等[15]以免疫荧光法检测人结肠MP内神经元HuC/D表达，结果显示神经元总数量随增龄显著下降。本研究对6、18和25月龄大鼠结肠MP神经节和神经元的形态学变化以及相关指标进行分析，结果显示神经节密度和每个神经节内神经元数量均随增龄显著下降，而神经节、神经元及其胞核的面积随增龄显著增加，神经纤维排列逐渐紊乱，这些变化可能是对神经元丢失产生的代偿反应[14-16]。

MP神经元依据神经递质的不同可分为多种亚型，胆碱能神经元是ENS的主要兴奋性神经元。本研究发现，大鼠结肠组织AChE阳性神经元随增龄逐渐减少，与Sun等[14]的研究结果一致。在体外，以同等强度的电流刺激青年组和老年组狒狒结肠平滑肌，老年组肌肉收缩力显著下降，但加入胆碱能受体抑制剂阿托品后，再给予两组同等强度的电刺激，老年组平滑肌收缩抑制作用显著低于青年组，提示老年组结肠MP内胆碱能神经元数量低于青年组[6]。

目前关于氮能神经元数量随增龄的变化尚存争议。Takahashi等[17]发现，随着增龄，Fisher大鼠每个神经节内nNOS免疫阳性神经元数量显著下降(P<0.01)，22～28月龄大鼠结肠组织nNOS mRNA和蛋白表达较4～8月龄组分别下降35%和54%。Gamage等[18]的研究发现，虽然18～19月龄和24～25月龄C57BL/6小鼠MP内NO能神经元数量无明显差异，但24～25月龄神经纤维密度增加，并可见轴突肿胀、扭曲等表现。本研究发现，nNOS免疫阳性神经元数量随增龄显著下降，神经纤维随增龄排列逐渐紊乱。推测神经元丢失后，尚存神经元之间联系减少，故神经纤维代偿性增粗、增长以加强神经元间信号传输。本研究中，与18月龄组相比，25月龄组AChE阳性神经元数量显著下降，而nNOS阳性神经元无明显变化，提示兴奋性神经元与抑制性神经元的老化可能是非同步的、不平衡的，且抑制性神经元受年龄的影响较小。

Cajal间质细胞(ICCs)位于消化道肌层内，是胃肠道慢波起搏细胞，与MP内神经元共同调节肠道运动。李永等[12]对3、9、18、24和30月龄SD大鼠肠道传输速度以及胃体、空肠、回肠、结肠和乙状结肠与直肠交界处5个部位的ICCs进行检测，结果发现20和24月龄组肠道传输速度减慢；各部位c-kit表达均随增龄而下降，尤以结肠与直肠交界处最为明显。Sun等[14]发现，24月龄C57BL/6J小鼠结肠ICCs显著下降。24月龄组Fischer344大鼠升结肠和降结肠c-kit表达显著低于6周龄组[19]。本研究中，25月龄SD大鼠c-kit表达显著低于6月龄组，与上述研究结果一致。

综上所述，本研究证实老年MP存在衰老(或称退化)和代偿现象，与老年人胃肠动力减退关系密切，为阐明胃肠动力障碍性疾病高发的机制提供了一些实验和理论依据。考虑到衰老是不可逆转的，而代偿是有限的，因此建议未来研究应关注MP神经递质的调节方面，为治疗老年人胃肠动力障碍性疾病寻找新的干预靶点。