Bruton酪氨酸激酶在对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤中变化及意义

刘晓庆，鲁桓兵，刘瑞雪，宋育林

对乙酰氨基酚 (acetaminophen,APAP)是目前普遍使用的解热镇痛剂，过量使用则可导致严重的肝功能损害甚至急性肝衰竭乃至死亡，是药物性肝损伤及肝衰竭的常见原因。APAP所致肝损伤发病机制复杂，涉及多种机制，可能与活性代谢产物的形成、氧化应激、内质网应激、自噬、无菌性炎症等有关[1]，确切机制目前仍不明确。核苷酸结合寡聚域样受体蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)是肝脏中研究较多的炎性小体，其活化后可引起白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-18等炎性因子的释放，参与APAP诱导的肝损伤[2]。Bruton酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)是胞浆非受体酪氨酸蛋白Tec家族成员之一，对B淋巴细胞的增殖、分化和凋亡起着重要的调控作用[3]。近期有文献报道[4]Btk是先天免疫炎性反应中的关键因子，可通过调控核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB) 引起NLRP3的激活，也可直接调控NLRP3的激活。已有研究[5]表明Btk参与缺血再灌注性肝损伤，抑制Btk可减轻肝脏的炎性损伤，然而其在APAP诱导的肝损伤中的作用及机制目前未见相关文献报道，该研究重点研究APAP诱导的肝损伤中Btk、磷酸化Btk(phosphorylated Btk，p-Btk)、NF-κB、NLRP3、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 的动态变化，从而探讨Btk在APAP肝损伤中的重要作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物54只SPF级健康成年的C57BL/6J雄性小鼠，鼠龄6～8周，体质量18～24 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。

1.2 实验材料与仪器APAP(纯度大于99%)购自美国MedChemExpress公司；小鼠TNF-α、IL-1β elisa试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司；Btk抗体[Btk(D3H5)Rabbit mAb×8547]、p-Btk抗体均购自美国Cell Signaling公司；NLRP3抗体购自英国Abcam公司；NF-κB抗体购自英国Abcam公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE (5×) 蛋白上样缓冲液均购自上海碧云天生物技术有限公司；全自动生化分析仪购自瑞士RocheModular 公司；紫外分光光度计购自上海菁华科技仪器有限公司产品；成像系统购自美国阿尔法公司产品。

1.3 方法

1.3.1实验分组与方法 适应性饲养1周后，54只小鼠随机分为9组，每周6只，分别为对照组(APAP 0 h组)、APAP 0.5 h组、APAP 1 h组、APAP 3 h组、APAP 6 h组、APAP 12 h组、APAP 24 h组、APAP 36 h组、APAP 48 h组，所有小鼠禁食不禁水12 h后，APAP 0.5 h组、APAP 1 h组、APAP 3 h组、APAP 6 h组、APAP 12 h组、APAP 24 h组、APAP 36 h组、APAP 48 h组小鼠分别单剂量腹腔注射APAP 300 mg/kg，对照组小鼠腹腔注射0.9%生理盐水同等体质量APAP组小鼠。所有小鼠自由进食水，明暗各12 h，温度20～25 ℃，相对湿度(50±5)%。所有小鼠均自由进食标准饲料。分别在相应的时间小鼠处死前称量小鼠体质量，用10%的水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后摘除小鼠眼球收集血液，断头处死。全血标本于4 ℃冰箱静置过夜后，3 500 r/min离心15 min留取上清液，-20 ℃冻存待测。剪取部分肝左叶用10%福尔马林缓冲液固定行肝脏病理学检查，其余肝脏组织冻存于液氮中，随后转移至-80 ℃ 冰箱储存待测。

1.3.2血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性检测 全自动化生化分析仪检测ALT、AST活性。

1.3.3肝组织病理学观察 经10%福尔马林缓冲液固定的肝脏标本，常规脱水，石蜡包埋，切片(厚5 μm)，HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理形态学改变。采用Image-Pro Plus 6.0高清晰图像分析系统进行分析。计算肝脏坏死面积百分比=(阳性细胞所占面积/整个视野总面积)×100%。

1.3.4ELISA检测肝匀浆IL-1β和TNF-α的表达 剪取-80 ℃冻存的肝组织按1 ∶9(g ∶ml)加入相应的PBS匀浆肝组织，留取上清液，严格按照试剂盒说明书操作步骤测定IL-1β、TNF-α。

1.3.5Western blot检测肝脏Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3蛋白表达 剪取适量的肝组织加入RIPA裂解液充分匀浆提取总蛋白。用BCA法进行蛋白定量。加入SDS-PAGE (5×) 蛋白上样缓冲液，沸水中煮沸 5 min，-80 ℃ 冰箱中冻存。以β-actin(1 ∶1 000)作为内参，以抗Btk抗体(1 ∶3 000)、抗p-Btk抗体(1 ∶1 000)、抗NF-κB抗体(1 ∶5 000)、抗NLRP3抗体(1 ∶2 500)和抗β-actin抗体(1 ∶1 000)作为一抗进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用自动化学发光系统拍摄分析。

2 结果

2.1 ALT和AST酶活性检测结果与对照组比较，APAP腹腔注射0.5、1 h组小鼠血清ALT、AST水平差异无统计学意义(P>0.05)；给药后3 h血清ALT、AST升高，持续至24 h仍维持在较高水平(P<0.01)，36、48 h血清ALT、AST下降，但仍高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 不同时间点血清ALT、AST变化

2.2 肝组织病理检查结果对照组，肝小叶结构正常，未见肝细胞变性、坏死以及肝窦充血。APAP处理后0.5、1 h肝脏病理形态学与对照组比较差异无统计学意义。APAP处理后3 h肝窦充血,可见点状坏死灶，APAP处理后6、12 h肝窦充血明显，坏死面积逐渐增大，持续至24 h，主要表现为小叶中心性坏死；APAP处理36 h后肝脏病理变化逐渐减轻，坏死面积逐渐减少。APAP干预后的各组小鼠肝脏坏死程度较对照组有变化(F=29.845，P=0.000)。见图1、2。

2.3 肝组织匀浆IL-1β、TNF-α检测结果与对照组比较，APAP腹腔注射1、3 h后，TNF-α、IL-1β分别开始升高，且均在24 h时含量最高(P<0.01)，后逐渐降低。见表2。

2.4 Western blot 检测结果与对照组比较，APAP干预后的各组小鼠肝脏Btk(F=441.280，P=0.000)、p-Btk(F=1 323.022，P=0.000)、NF-κB(F=133.125，P=0.000)及NLRP3水平(F=820.095，P=0.000)含量均有变化。正常肝组织中仅有少量的Btk表达，APAP处理组小鼠随着给药时间的延长，Btk及p-Btk的表达逐渐增多，于24 h表达最高(P<0.01)，后表达逐渐下降。NF-κB、NLRP3表达与Btk及p-Btk表达变化趋势相一致。见图3。

图1 不同时间点肝脏病理学变化 × 200

表2 不同时间点肝组织IL-1β、TNF-α表达量

图2 不同时间点小鼠肝脏坏死面积

3 讨论

APAP引起的肝损伤病理组织学主要表现为肝小叶中心性坏死[6-7]。ALT、AST是目前评价肝脏损伤程度的常用指标。本实验结果显示，小鼠单次腹腔注射APAP(300 mg/kg)0.5、1 h，血清ALT、AST及肝脏病理形态学与对照组无明显差异；其余各组血清中ALT、AST水平、3 h后各组肝细胞坏死面积明显高于对照组，同时肝脏HE染色也可见不同程度的肝窦充血。这些生化及病理改变与相关文献报道[6-7]一致，提示APAP诱导的小鼠肝损伤模型复制成功。本实验研究发现APAP(300 mg/kg)单次干预造成的肝损伤并非完全随时间的延长而加重，36 h后肝损伤的程度有所减轻，提示单次APAP造成的小鼠肝损伤存在自身修复过程。

图3 各组小鼠肝组织Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3蛋白表达情况

APAP诱导的肝细胞坏死的发生与过量服用APAP或肝脏基础水平还原型谷胱甘肽被耗竭，代谢产生的N-乙酰对苯醌亚胺不能被肝脏还原型谷胱甘肽结合，造成肝细胞代谢损伤和氧化应激损伤，破坏线粒体膜等有关[1]。Btk是一种非受体型酪氨酸激酶，表达于除T淋巴细胞及浆细胞的髓系细胞。Btk通过调控中性粒细胞募集和激活参与炎症过程[5]。当细胞受到细菌、真菌、病毒及其他危险信号的刺激时，Btk以磷酸化的形式活化后可直接调节NLRP3或间接调节NLRP3等信号进而引起炎性因子的释放[3-4]。Btk参与调控多个重要炎症信号转导通路中许多关键的信号蛋白，包括NF-κB、NFAT、PKC、Pin1、TLRs、caveolin-1 等[8]。近期研究[5]表明在小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中，Btk抑制剂可减轻缺血再灌注引起的肝脏炎性损伤。本实验结果显示：正常小鼠肝组织中仅有少量Btk表达；APAP作用24 h内，随着APAP作用时间的延长，小鼠肝组织中Btk及p-Btk逐渐升高，肝损伤的严重程度与Btk及p-Btk表达变化趋势相一致。提示Btk的活化参与了APAP肝损伤病理的形成。

Btk是先天免疫炎性反应中的关键因子，参与调控炎症信号转导通路中许多关键的信号蛋白[4,8]，其参与APAP诱导的肝损伤可能作用机制为：① 激活NF-κB导致NLRP3形成及炎性因子升高。文献报道Btk/NF-κB信号通路可参与视神经脊髓炎的发病，引起急性炎症[9]。NF-κB可激活NLRP3炎性体造成炎性因子过度表达，进而导致炎症和自身免疫疾病的进展[10-11]。抑制Btk、NF-κB信号通路可显著控制炎症及减轻疾病[12-13]。通过药物或遗传手段抑制Btk可严重抑制NLRP3炎性小体的激活，减轻IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的释放，进而减轻缺血性脑损伤引起的炎性反应[14]。本实验结果显示，正常小鼠肝组织中仅有少量Btk表达，随着APAP作用时间的延长，小鼠肝组织中Btk及p-Btk逐渐升高，NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表达也逐渐升高，肝损伤的严重程度与Btk及p-Btk、NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表达变化趋势相一致。表明Btk磷酸化可能激活了NF-κB导致NLRP3形成及炎症因子升高引起了肝损伤。② 直接激活NLRP3炎性小体。NLRP3炎症小体的激活一方面主要通过激活NF-κB通路上调NLRP3和 pro-IL-1β的蛋白表达，另一方面线粒体DNA,穿孔毒素，病原体相关成分等信号也参与其激活[15]。近年来有文献[14]报道Btk是NLRP3炎性小体的重要组成部分，在炎症小体中起重要作用，可通过物理方式直接与NLRP3、ASC相互作用，激活炎性反应，引起炎性损伤。但APAP导致的急性肝损伤中，Btk激活NLRP3的确切机制尚有待进一步探讨。

综上所述，本研究结果显示，Btk在单次APAP致肝损伤的过程中存在动态变化，APAP诱导的肝损伤中Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表达变化与肝损伤的严重程度基本相一致，表明Btk可能在APAP肝损伤中起着重要作用，将为寻找APAP肝损伤新的防治靶点提供了理论基础。