弗劳地枸橼酸杆菌分离鉴定及其三重PCR 检测方法的建立

张楠驰，王 利*

（1. 西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041；2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川 成都 610041）

弗劳地枸橼酸杆菌（Citrobacter freundii）为肠杆菌科枸橼酸杆菌属的革兰氏阴性杆菌，其菌体形态与大肠埃希菌相似，有鞭毛无芽孢无荚[1]。弗劳地枸橼酸杆菌在临床中是一种较常见的条件致病菌，在机体免疫力低下时，可能引起体表伤口组织或体内组织感染，如引起人类的脑脓肿、高死亡率的菌血症以及呼吸道、消化道、泌尿系统感染等疾病[2-3]。罗琳等从肾病患者尿液中分离到该菌[4]，Chen 等报道了9 名新生儿由该菌引起败血症的研究[5]。感染弗劳地枸橼酸杆菌对动物的健康也存在一定威胁。王利等在2011 年首次从患病鲫鱼肠道中分离出弗劳地枸橼酸杆菌[6]，Goldberg 等发表了一例海龟感染弗劳地枸橼酸杆菌而致死的报道[7]。同时，弗劳地枸橼酸杆菌与散发和爆发腹泻有关，对人的食品安全和动物的饲料安全带来威胁[8-9]。因此，高效、准确、快速地鉴定弗劳地枸橼酸杆菌非常重要。本实验室2018 年10 月在成都某养殖场发现一批嘴部有乳白色溃烂伤口、肛门红肿、腹部有出血点的患病鲫鱼，本研究对其分离得到菌株fsznc-08，进行了常规分子生物学鉴定，确证其为弗劳地枸橼酸杆菌。进一步针对该菌的GalF 基因、petA 基因和FliC 基因设计3 对特异性引物，建立一种可以快速、准确、有效的检测该菌的三重PCR 方法，以期为临床中弗劳地枸橼酸杆菌的检测提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 病原菌、实验动物及主要试剂枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、链球菌（Streptococcus）、杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、厦门希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、类志贺邻单胞菌（Plesiomons shigelloides）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、无丙二酸枸橼酸杆菌（Citrobacter amalonaticus）均保种于西南民族大学动物科学国家民委重点实验室。

患病鲫鱼来自成都某养殖场，其临床症状为嘴部有乳白色溃烂伤口、肛门红肿、腹部有出血点；健康成年鲫鱼（500±50 g）和鲫鱼鱼苗（75±25 g）购自成都某市场。LB 培养基、MBS 培养基、MRS 培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；PCR 聚合酶（1.1×T3 Super PCR Mix）、细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；细菌生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；标准革兰氏染色试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司。

1.2 病原菌的分离、培养和生理生化鉴定利用无菌接菌环在病鱼嘴部伤口取样并接种于LB 固态培养基中，28 ℃恒温培养18 h 后挑取外观一致的单菌落，并对其进行细菌纯化培养。采用革兰氏染色法对细菌菌体进行染色，显微镜下观察其颜色和形状。采用细菌生化鉴定管进行生化鉴定，鉴定标准参照《伯杰细菌鉴定手册》[1]。

1.3 分离菌16S rDNA 扩增及序列分析利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取分离菌总DNA 为模板，采用16S rDNA 通用引物（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/CTACGGCTACCTTGTTACGA）进行PCR 扩增。PCR 反应条件：98 ℃2 min；98 ℃10 s、55 ℃10 s、72 ℃30 s，共30 个循环；72 ℃2 min。PCR 产物经纯化回收后由上海生工生物工程技术服务有限公司双向测序并拼接。取得拼接后的16S rDNA 序列后，提交至GenBank 获取登录号，并在GenBank 上进行BLAST 序列比对，利用Mega 5.0 软件构建系统进化树。

1.4 分离菌回归感染试验采用常规方法收集分离菌体，用灭菌生理盐水制备浓度为3×109cfu/mL 的菌悬液，选取健康成年鲫鱼（500±50 g）和鲫鱼鱼苗（75±25 g）各10 尾，分别经腹腔注射0.1 mL 菌悬液，另选取10 尾健康鲫鱼腹腔注射0.1 mL 生理盐水作对照，饲养7 d 观察发病和死亡情况。对病鱼和死鱼解剖，取嘴部溃烂组织和肠道内容物涂布于LB 固态培养基，并对生长出的菌株进行分离培养和鉴定。

1.5 引物的设计与合成参考GenBank 登录的弗劳地枸橼酸杆菌GalF 基因、petA 基因和FliC 基因序列，采用Primer Premier 5.0 软件设计3 对特异性引物（表1）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，工作浓度均为10 μmol/L。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.6 单一PCR 反应条件的建立各基因单一PCR总体系为25 μL，各组分含量分别为：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，分离菌DNA 模板1 μL，各基因各上下游引物1 μL。反应条件：98 ℃2 min；98 ℃10 s、（45 ℃～64 ℃）15 s、72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃2 min。采用2.0%琼脂糖凝胶电泳观察PCR 扩增结果，确定三对引物的共同最佳退火温度。

1.7 三重PCR 反应条件的建立根据1.6 建立的单一PCR 扩增条件，采用方阵法对三重PCR 各引物比例（从1∶1∶1 开始，通过观察扩增目的条带的亮度，调节对应引物对的添加比例），退火温度（45 ℃～64 ℃范围16 个温度梯度）进行筛选。采用2.0%琼脂糖凝胶电泳观察PCR 扩增结果。

1.8 特异性试验采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取西南民族大学动物科学国家民委重点实验室保存的各菌种基因组作为模板，按照优化后的反应条件进行三重PCR 扩增，设无菌水为阴性对照，分离菌株fsznc-08为阳性对照，以检测该方法的特异性。

1.9 敏感性试验采用分光光度法检测分离菌基因组DNA 浓度后，用无菌去离子水10 倍倍比稀释（102～1011）后分别作为模板，按照建立的三重PCR 方法进行扩增，以检测该方法的敏感性。

1.10 多重PCR 检测法的临床应用采用1.5 的方法人工回归感染鲫鱼15 尾，发病后采集病样并提取细菌DNA。利用本实验建立的三重PCR 检测方法检测样品，并采用文献[10]建立的弗劳地枸橼酸杆菌PCR 检测方法进行复检，验证二者之间的符合率。

2 结 果

2.1 分离菌的形态学和理化特性鉴定结果分离菌接种LB固态培养基培养后可见直径为2 mm～4 mm，边缘整齐的灰白色菌落。革兰氏染色可见多数成对或成片排列的红色杆状菌体，表明该菌为革兰氏阴性杆菌。该菌理化特性试验结果详见表2。该分离菌菌株形态学和理化特性与《伯杰细菌鉴定手册》[1]中关于弗劳地枸橼酸杆菌的描述基本一致，将其命名为fsznc-08。

表2 生理生化试验结果Table 2 Results of physiology biochemical characteristics

2.2 分离菌16S rDNA 扩增及序列分析结果16S rDNA 经PCR 扩增后结果显示，得到约为1 500 bp 的片段。经测序结果显示，分离菌株16S rDNA 片段长度为1 406 bp。将分离菌株16S rDNA 基因序列提交到GenBank 中获得登录号MN159062。系统发育树结果显示，菌株fsznc-08 的16S rDNA 基因序列与Citrobacter freundii BAC007 的16S rDNA 基因序列置信度为100（图1），结合分离菌株形态学和理化特性，综合判定菌株fsznc-08 为弗劳地枸橼酸杆菌（Citrobacter freundii）。

图1 菌株fsznc-08 16S rDNA 基因序列与相关菌株的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of strain fsznc-08 16S rDNA gene sequence and its relatives

2.3 分离菌动物回归试验结果健康鲫鱼经腹腔注射菌株fsznc-08，进行动物回归实验，结果显示，感染成鱼组2 d 内死亡2 尾，7 d 内死亡8 尾，其余2尾均出现体表溃烂的症状；感染鱼苗组2 d 内死亡10 尾；对照组未见异常或死亡鱼。死亡和病鱼症状表现为嘴部严重溃烂、头部局部皮肤完全缺失、肛门红肿、部分腹部有出血点、胃肠充血，症状与自然感染的病鱼相似。采集病鱼嘴部溃烂组织和肠道内容物，可分离到大量与fsznc-08 菌落形态相似的菌株，经分子生物学鉴定确认其为弗劳地枸橼酸杆菌。表明本研究分离的弗劳地枸橼酸杆菌fsznc-08株为本次疾病的致病菌。

2.4 单一PCR和三重PCR扩增结果将各引物进行单一PCR 扩增，分别得到长度约为110 bp、270 bp 和540 bp 的条带（图2）。经测序，GalF-1、petA-4 和FliC-2 分别为106 bp、261 bp 和536 bp，与对应参考序列同源性分别为97%、99%和97%，均与预期结果一致。

经优化，三重PCR最佳反应体系为：1.1×T3 Super PCR Mix，19 μL；菌株fsznc-08 DNA模板，2 μL；引物量分别为：GalF-1F 0.8 μL，GalF-1R 0.8 μL，petA-4F 0.4 μL，petA-4R 0.4 μL，FliC-2F 0.8 μL，FliC-2R 0.8 μL。最佳反应条件为：98 ℃2 min；98 ℃10 s、47.8 ℃15 s、72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃2 min。按照上述反应参数进行扩增，同时得到约530 bp、260 bp 和110 bp 的目的片段（图2）。

图2 特异性引物扩增Fig.2 PCR amplifications withspecific primers

2.5 特异性试验结果对该三重PCR 方法进行特异性试验，结果显示，仅菌株fsznc-08 基因组DNA经三重PCR 扩增出现3 条清晰目的条带，片段大小分别为106 bp、261 bp 和536 bp ，而链球菌、杀鱼爱德华氏菌、霍乱弧菌、温和气单胞菌、蜡样芽胞杆菌、厦门希瓦氏菌、维氏气单胞菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、类志贺邻单胞菌、霍氏肠杆菌和无丙二酸枸橼酸杆菌的基因组DNA 经三重PCR 扩增均未扩增出3 条目的条带（图3）。表明建立的多重PCR 方法特异性好。

图3 三重PCR 的特异性试验Fig.3 The specificity test of the triplex PCR assay

2.6 敏感性试验结果以不同稀释度的菌株fsznc-08 基因组DNA 为模板进行多重PCR 扩增，结果显示，多重PCR 对GalF-1、petA-4 和FliC-2 的最低检出限分别为3.08×100拷贝/μL、1.25×100拷贝/μL和6.09×101拷贝/μL（图4）。表明本研究建立的三重PCR 方法敏感性较高。

图4 三重PCR 敏感性试验Fig.4 The sensitivity test of the triplex PCR assay

2.7 三重PCR 检测方法临床应用结果采用本实验建立的三重PCR 检测方法对15 尾病鱼肠道内容物进行检测，结果显示，14 个样品呈阳性（图5），阳性检测率约为93.33%。同时，采用文献[10]PCR 检测方法进行复检，结果一致（图6）。表明本实验建立的三重PCR 方法适合应用于临床样品的检测。

图5 临床样品三重PCR 检测结果Fig.5 Detection results of clinical samples by triplex PCR assay

图6 临床样品单一PCR 检测结果Fig.6 Detection results of clinical samples by single PCR

3 讨 论

近年来人类和动物感染弗劳地枸橼酸杆菌的报告逐年增加，成为临床中常见致病菌之一[11]。王利、石征宇、张冬星和王家祯等分别从患病鲫鱼肠道、罗非鱼心脏、团头鲂肝和青鱼肝中分离到该菌[6,12-14]。石征宇等研究表明，弗劳地枸橼酸杆菌对罗非鱼、草鱼、黄颡鱼和禾花鲤具有较强的致病性[12]。弗劳地枸橼酸杆菌作为人畜生存环境中的条件致病菌，营养不良、机体免疫力较差成为该菌的主要易感因素[15-16]。养殖动物感染弗劳地枸橼酸杆菌，不但会影响动物健康和养殖环境，其作为一种食源性致病菌也对人类食品安全造成较大的威胁。采用快速检测的方法可在生产中预防由劳地枸橼酸杆菌引起的细菌污染，可在一定程度上预防由该菌引起的食源性疾病。

快速检测细菌的分子生物学检测技术主要有常规PCR 技术、多重PCR 技术。常规PCR 技术主要是扩增细菌的一条特异性基因。谭秋杉等通过扩增部分16S rDNA 基因保守序列鉴定不同血清型鸭疫里默氏杆菌[17]。毕水莲通过扩增部分弓形菌23S rDNA 基因序列鉴定该菌[18]。而不同细菌间16S rDNA 基因、23S rDNA 基因序列具有一定同源性，这将对该检测方法的特异性产生一定的影响。多重PCR 技术具有高效性、系统性、经济简便性等特点，与常规PCR技术相比具有更高的特异性和敏感性，在细菌快速检测方法有着重要的临床意义和广泛的应用前景。刘变芳等构建的生鲜肉产毒素大肠杆菌多重PCR 检测法，可快速、批量地筛选出可疑ETEC（产肠毒素性大肠杆菌）污染的样品[19]。丁天翊等建立的多重PCR 方法可快速、准确检测出奶牛乳房炎4 种病原菌[20]。影响多重PCR 检测的效果的因素有很多，模板浓度、引物特异性和稳定性等均会影响检测效果。目前，已有多种形式的多重PCR 检测方法，如利用多条毒力基因检测一种或多种细菌[21]、利用数条特异性基因同时检测数种细菌[20]等，此类方法通过一条特异性基因或多条非特异性基因（如毒力基因、16S rDNA 和23S rDNA 序列）判断样品中是否含有目的细菌，但检测方法的特异性和准确性欠佳。本实验设计3 个基因GalF、petA 和FliC 的引物，引物均通过BLAST 比对和筛选，比对结果中只包含弗劳地枸橼酸杆菌序列，同时采用这3 对特异性引物扩增GalF、petA 和FliC 基因能够快速检测出弗劳地枸橼酸杆菌，并且本实验方法在临床应用中得到验证。综合引物特异性、敏感性试验和临床应用结果，本实验建立的检测弗劳地枸橼酸杆菌的三重PCR 检测法可在2 h 内完成检测，同时降低了鉴定细菌的成本，具有良好的应用前景。

本实验从病鲫鱼中分离出弗劳地枸橼酸杆菌，经人工回归感染试验验证了该菌株为病原菌，并建立了一种快速、准确地检测弗劳地枸橼酸杆菌的三重PCR 方法，该方法具有特异性强、敏感性高、操作简单、成本低的特点。本研究为弗劳地枸橼酸杆菌的快速检测提供了可行方法。