孕鼠双酚A染毒对雄性子鼠睾丸结构及MnSOD-SIRT3蛋白表达的影响

杨小四 苏会萍 杨元元 胡华麟 蒋鹤飞

安庆医药高等专科学校医学基础部 安徽 安庆 246052

双酚A(bisphenol A，BPA)是一种环境内分泌干扰物，广泛存在于食品饮料包装、粘合剂及纸张涂料中[1]。目前，研究提示，BPA对人体免疫系统、神经系统、胚胎发育等都存在不利影响，尤其是生殖系统[2]。BPA影响机体的作用机制复杂多样， BPA可引起睾丸生精小管内生精细胞、支持细胞内氧化应激水平升高，导致细胞凋亡。锰超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，MnSOD)定位于线粒体，可抑制细胞内氧化能量和自由基产生的场所，为抗氧化损伤重要作用[3]；去乙酰化酶(sirtuins, SIRTs)家族中的SIRT3是线粒体中去乙酰化酶，可以调节线粒体抗氧化应激作用[4]。BPA对雄性子鼠睾丸组织的生殖毒性是否与氧自由基清除剂MnSOD和SIRT3参与有关目前尚不明确。该研究拟采用 HE染色、电镜观察孕鼠染毒后对雄性子鼠睾丸生殖细胞的结构改变，Hoechst染色显示细胞凋亡及Western blot测睾丸组织MnSOD、SIRT3蛋白表达，为进一步探讨BPA对生殖系统的毒理作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 BPA(美国Sigma公司，纯度>99.9%)；兔抗鼠多克隆抗体MnSOD、SIRT3、GAPDH(美国Santa Cruz有限公司)；Hoechst 33258染色试剂盒、羊抗兔免疫组化二抗试剂盒(碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜、Super Singal化学发光试剂盒(美国Pierce公司)；实验所需其他试剂均为分析纯。80i生物显微摄像和分析系统(日本Nikon 公司)；日本JEM-1230型透射电子显微镜等。

1.2 实验动物 8～10周龄成年ICR小鼠90只，购于安徽省实验动物中心(皖动准字2017-01号)，其中雌鼠60只，雄鼠30只，体质量为(28.5±2.2)g。饲养条件为：室内恒温为(22±2)℃，采取日光灯照明维持昼夜节律，每天12 h光照/12 h黑暗，自由摄食和饮水，每周更换3次垫料。本研究动物处理遵循安徽省实验动物管理和使用规范。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与给药 ICR小鼠在实验中心适应性饲养1周后，于实验前晚上以雌鼠∶雄鼠为2∶1合笼，次日检查ICR雌鼠阴栓，显微镜下查阴道涂片确定有精子的记为妊娠第0天(PGD0)。随机将受孕后的ICR雌鼠分为4组，参考本研究组前期实验结果[5]溶剂对照组、BPA低剂量组(饮水摄入10 nmol/L BPA)、中剂量组(饮水摄入50 nmol/L BPA)、高剂量组(饮水摄入300 nmol/L BPA),染毒。雄性仔鼠产后6周(PGD42)处死，无菌取雄性ICR仔鼠睾丸组织，进行形态学检查，部分睾丸组织无菌环境下放置液氮冻存备测。

1.3.2 HE染色和电镜观察睾丸组织结构改变 HE染色睾丸标本制备，取睾丸组织，用10%福尔马林溶液固定, 常规脱水制片， HE染色，Nikon显微摄像系统病理学观察；电镜标本制备，将新鲜组织固定于2%戊二醛溶液中，进行超薄切片，枸橼酸铅染色，JEM-1230型透射电镜观察并摄片。

1.3.3 Hoechst 33258染色观察雄性仔鼠睾丸组织细胞凋亡情况 取新鲜雄性ICR仔鼠睾丸组织，10%福尔马林溶液固定。常规石蜡包埋，德国Leica公司RM2135型切片机厚3 μm切片，常规脱腊后，PBS缓冲液清洗3次×5 min/次，吸水纸吸尽残存液体。每块切片加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，避光染色10 min。PBS缓冲液清洗3次×5 min/次。将切片加上抗淬灭封片液，置于载玻片上，日本Nikon荧光显微镜观察并摄片记录。

1.3.4 Western blot检测雄性仔鼠睾丸组织中MnSOD、SIRT3蛋白表达情况 取出液氮中前期冻存的睾丸组织，照试剂盒操作步骤进行，检测蛋白浓度，在细胞中添加水浴锅内进行煮沸变性10 min，定量，-80℃保存备用。配胶，每孔30 μg蛋白上样量，按照二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法总蛋白抽提试剂盒说明书，配置细胞裂解液，匀浆、离心(速度3000 r/min，15 min)蛋白定量后，30 μg蛋白上样，十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate，SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，250 mA恒流条件下，将蛋白湿性转移至硝酸纤维素(PVDF)膜上，室温下封闭60min；加入兔抗鼠MnSOD多克隆抗体(1∶1 500)、SIRT3多克隆抗体(1∶2 000)一抗，4 ℃冰箱孵育过夜。次日，Tris缓冲液(TBST)洗膜5 min×3次后，加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，37℃孵育30 min。显色采用超敏ECL化学发光法，以GAPDH为内参照，Image J软件分析灰度值作半定量分析，实验重复5次。

2 结果

2.1 雄性仔鼠睾丸的组织病理学改变 孕期母鼠饮水染毒的雄性仔鼠睾丸组织的形态结构经常规HE染色显示，溶剂对照组的睾丸组织结构未见明显异常改变，生精小管内可见多层生精细胞层，基底部的精原细胞排列规则，从基底面向腔面可见排列正常各级生精细胞和精子，生精小管周围可见嗜酸性的睾丸间质细胞，表明仔鼠已发育为成年。而BPA染毒后，生精小管内生精细胞排列紊乱，细胞数量和层数较对照组明显减少，尤其是BPA中剂量组、高剂量组，睾丸组织中生精细胞形态损伤严重，细胞排列松散，仅在基膜附近有少量生精细胞，见图1，表明BPA对睾丸组织的损伤具有剂量依赖性，随着BPA剂量的增加损伤加重。

2.2 雄性仔鼠睾丸的生精细胞结构变化 溶剂对照组仔鼠生精细胞内细胞器未见明显异常；低剂量孕鼠染毒BPA组仔鼠睾丸内生精细胞线粒体边界模糊，细胞器肿胀，随着孕鼠染毒BPA剂量的升高，中剂量组、高剂量组仔鼠睾丸内生精细胞病理学改变明显，胞线粒体嵴消失，呈明显空泡样改变，见图2。

2.3 Hoechst染色观察雄性仔鼠睾丸的生精细胞凋亡改变 溶剂对照组仔鼠各级生精细胞、间质细胞和支持细胞的核呈较为均匀的蓝色；孕鼠染毒BPA后，低剂量组、中剂量组仔鼠精原细胞和间质细胞的核出现明显固缩，呈致密浓染；高剂量组仔鼠精原细胞和间质细胞的核发生固缩更为明显，见图3。

2.4 雄仔鼠睾丸组织中MnSOD、SIRT3蛋白的表达 蛋白免疫印迹结果显示，MnSOD蛋白、SIRT3蛋白在溶剂对照组仔鼠睾丸组织中呈高表达，孕期母鼠染毒BPA后，仔鼠睾丸组织中MnSOD蛋白、SIRT3蛋白在低剂量组、中剂量组、高剂量组间表达呈下降趋势；采用Image J软件，进行灰度比值半定量分析，结果表明，与溶剂对照组相比，母鼠染毒BPA后，各剂量组仔鼠睾丸组织中MnSOD/GAPDH、SIRT3/GAPDH表达降低，P<0.05或0.01)。

3 讨论

环境类雌激素BPA广泛存在于日常生活中，诸如塑料制品和脂类添加剂中。研究发现，低剂量的BPA 即对机体生殖系统[6]、内分泌系统[7]、免疫系统[8]、胚胎发育[9]等方面具有长期的毒性作用。本动物实验研究显示，出生前母鼠染毒BPA，成年雄性仔鼠睾丸组织呈现明显病理形态学学改变，表现为生精小管层数的减少，高剂量染毒组，成年仔鼠睾丸组织中中生精细胞数量明显减少，由对照组的4～5层几乎演变为单层，表明，孕期过量染毒BPA对子代生殖系统有较大的影响。这可能与目前由于塑料制品的广泛使用，导致临床上男性不孕症呈上升趋势。BPA可通过雄性小鼠睾丸中的血睾屏障，导致小鼠生精小管中的生精细胞失去支持细胞的紧密连接，使得支持细胞对生精小管中的各级生精细胞的支持、营养作用下降，导致生精细胞的数量降低，干扰了精子的正常生长发育[10]。同时，本实验观察到，染毒BPA组仔鼠生殖细胞中线粒体结构发生改变，尤其在中、高剂量组，生精细胞的分化、成熟需要充足能量，而生殖细胞中线粒体的肿胀损伤，表现为线粒体嵴消失，呈空泡样改变，必然会影响其能量合成，从而影响生精细胞、支持细胞和间质细胞的数量和功能。Hoechst染色也显示，母鼠染毒BPA后，仔鼠睾丸组织中生精细胞、间质细胞和支持细胞出现程度不等的凋亡，主要表现为精原细胞和间质细胞核发生固缩。

氧自由基清除剂MnSOD位于线粒体中，为机体一种抗氧化酶，可以催化超氧阴离子歧化反应，降低细胞中ROS 的过度增加，维持机体组织细胞的氧化还原平衡，清除活性氧的损害。反之，当细胞中MnSOD表达减少，组织细胞中线粒体内 ROS 升高， ROS 过量增加可损伤细胞DNA 结构，改变细胞周期，影响细胞增殖[11]。SIRT3 为真核生物体内具有高度保守性的去乙酰化酶，可以调节线粒体内组蛋白/非组蛋白的去乙酰化，从而调节组织细胞的能量代谢，增加机体清除氧自由基能力[12]。而且，SIRT3可以导致MnSOD 122位赖氨酸残基脱乙酰化，对MnSOD具有活化功能，从而降低机体线粒体产生ROS，有效防止 ROS 的蓄积[13]。本研究采用Western blot检测，结果表明，孕鼠BPA染毒不同剂量BPA后，与对照组比较，染毒的子鼠睾丸组织MnSOD、SIRT3蛋白表达呈降低趋势，且随着孕鼠染毒BPA浓度的增加，仔鼠MnSOD、SIRT3表达呈降低趋势。

综上所述，孕鼠进行BPA染毒，可导致子代雄性小鼠生精细胞、支持细胞和间质细胞的凋亡，数量减少，线粒体损伤，这种损伤的机制可能与小鼠睾丸组织细胞MnSOD、SIRT3蛋白表达降低有关。