白凤菜总黄酮对多发性骨髓瘤U266细胞增殖和凋亡影响

刘慧丽 阙文忠 林燕燕 林泽燕 徐文鑫

1 漳州卫生职业学院医学技术系/转化医学检测应用技术协同创新中心 福建 漳州 363000;2 福建医科大学附属南平第一医院风湿免疫科 福建 南平 353000；3 漳州卫生职业学院药学系 福建 漳州 363000;

多发性骨髓瘤迄今仍是一种无法治愈的血液系统恶性肿瘤[1]。它具有很强的侵袭性生长能力，瘤细胞通常可以侵犯到全身骨骼。虽然许多药物例如硼替佐米、沙利度胺的使用，配合自体干细胞移植等手段大大改善了其预后，但最终无法避免复发和耐药等问题[2-4]。因此，仍迫切需要寻找新的治疗药物。

植物总黄酮具有抗氧化、抗肿瘤等多种活性，尤其在抗肿瘤的开发中有潜在的价值。有文献报道其在肺癌、宫颈癌、肝癌等实体瘤细胞体外实验均有诱导凋亡的作用[5-8]，但对血液系统的肿瘤研究未见报道。本课题组从白凤菜(Gynura formosana Kitam)中提取了白凤菜总黄酮(total flavonoids of Gynura formosana Kitam，TFG)，旨在体外观察TGF对多发性骨髓瘤U266细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用，为将来TFG用于骨髓瘤的治疗研究奠定理论实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 U226细胞由本实验留存传代；RPMI 1640培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)和胎牛血清购于美国Sigma公司;MTT细胞凋亡试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒、线粒体膜电位、细胞周期检测试剂盒、0.22 μm的滤膜均购自上海碧云天公司; 荧光显微镜、多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific公司; 流式细胞仪购自美国BD公司; 倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 TFG的制备 白凤菜乙醇提取液转入大孔树脂柱，用70%(体积分数，下同)乙醇洗脱,将洗脱液旋转蒸发浓缩，获得TFG浸膏，所得浸膏用双蒸水溶解,将溶解液依次经0.45和0.22 μm的滤膜过滤,最终获得TFG样液，根据亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法使样液显色,测定吸光度[9]，计算样液中的TFG含量为2.76 mg/mL。

1.3 细胞培养 将U266接种于含有10 %胎牛血清的RPMI1640培养液中, 37℃、5% CO2、湿度饱和的恒温培养箱中培养,每1～2天传代1次，取对数生长期细胞为实验对象。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞存活率检测 收集对数生长期的细胞，以5×103个/孔接种于96孔板，设4个重复孔，各组加TFG至终质量浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，于37℃、5%CO2培养箱中孵育24和48 h。每孔加入10 μL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解，在570 nm测定吸光度，计算细胞存活率和抑制率。96孔板上无细胞只有营养液和MTT反应试剂的孔为空白组，有U266细胞而未添加TFG的孔为阴性对照组.计算细胞存活率和抑制率。细胞存活率=(A实验-A空白)/(A对照-A空白)100%；抑制率=1-细胞存活率。

1.4.2 细胞形态学观察 收集细胞,以5×105个/孔接种于6孔板，孵育过夜后，设置各实验组TFG终浓度为0、25、50和100 μg/mL,于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，随后在倒置显微镜下进行细胞形态学观察并拍照。

1.4.3 线粒体膜电位检测 U266细胞用TFG终浓度为0、25、50和100 μg/mL作用24 h后，1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。重悬细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入188 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入2 μL Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育20～30 min，孵育过程中重悬细胞2～3次，随后置于冰浴20 min，1 000 g离心5 min，收集细胞，用100 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，荧光显微镜检测。

1.4.4 细胞凋亡检测 取处于对数生长期的U266细胞，以10×104个/mL接种3 mL于6孔板，培养箱中孵育过夜.各组分别用0、25、50和100 μg/mL的TFG作用于细胞48 h后各自收集培养体系内全部细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI染色液，轻轻混匀。室温25℃避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中，随后流式细胞仪检测。

1.4.5 细胞周期检测 取处于对数生长期的U266细胞，以5×104个/ mL接种3 mL于6孔板，培养箱中孵育过夜。各组分别用0、25、50和100 μg/mL的TFG作用于细胞24 h后各自收集培养体系内全部细胞，用PBS洗涤2次, 1 000 g离心5 min，弃去PBS。用-20℃预冷的70%乙醇重悬，于4℃静置1 h，1000 g离心5 min，收集沉淀，用PBS洗涤2次，并用500 μL PBS重悬。加入5 mL PI(10 mg /mL)染液和2.5 μl RNaseA(20 mg /mL)，避光、室温孵育30 min。300目尼龙筛过滤细胞，进样于流式细胞仪检测计算G0/G1、S、G2/M期所占百分比。

2 结果

2.1 TFG对骨髓瘤U266细胞体外增殖的影响 TFG对骨髓瘤U266细胞的体外增殖有明显的抑制作用。与对照组相比，12.5、25、50和100 μg/mL的TFG作用不同时间后，骨髓瘤U266细胞存活率逐渐降低，P<0.05，可见抑制作用呈现浓度和时间依赖效应，见图1。

2.2 TFG对骨髓瘤U266细胞形态的影响 随着TFG药物浓度的增大，U266细胞数量减少，形态皱缩、边缘粗糙、胞体缩小、胞体折光度减小和内含物减少，见图2。

2.3 细胞荧光凋亡检测 对照组中细胞核排列比实验组紧密，核染色质分布均匀，发出红色荧光，未见绿色凋亡荧光细胞；25 μg/mL TFG实验组中细胞排列紧密，发出红色荧光，较对照组可见散在绿色凋亡荧光细胞；50 μg/mL TFG实验组中细胞数量减少，较多细胞出现明亮绿色荧光细胞，表明部分细胞的细胞膜受损；100 μg/mL TFG实验组中细胞数量明显减少，部分细胞胞体肿胀，发生染色质凝集和细胞膜破损，较多细胞核发出明亮绿色荧光，见图3。

2.4 TFG对U266细胞凋亡的影响 处理24 h后，与对照组相比，随着TGF浓度的增加，细胞凋亡比例逐渐增加，P<0.05，见图4。

2.5 TFG对U266细胞周期分布的影响 处理24 h后，与对照组相比，随着药物浓度的增加，S期的细胞百分比明显增多，P<0.05；而G2/M期的细胞百分比逐渐下降，P<0.05，见图5。

而本研究结果显示TGF作用U266细胞24及48 h的IC50分别为46.6和10.45 μg/mL，药效更为显著。在线粒体膜电位荧光凋亡检测中也显示，随着TGF的浓度增高，在药物作用下，磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)，从质膜的内部外翻到细胞表面即细胞膜外侧，从而使PS暴露于细胞外部，与带有绿色荧光的FITC标记的AnnexinV染色，结果显示细胞凋亡与药物作用的浓度正相关，流式细胞仪凋亡检测也显示随着药物溶度的增加，凋亡增加明显，100 μg/mL凋亡细胞增加明显占97%。细胞周期检测表明TGF可影响U266细胞周期分布，使细胞周期阻滞于S期。

3 讨论

自然来源的营养素能有效消除癌症细胞，探索天然、高效和低毒的药物进行长期的辅助抗癌具有重要意义。白凤菜中的丰富的黄酮成分，有学者体外实验证实改成能有效抑制肺癌、食管癌、宫颈癌等实体瘤细胞株。在本课题组前期研究中已被证实对肝癌HepG2细胞亦有明显的诱导凋亡作用[10]，TGF作用24及48 h的IC50分别为190.80和125.96 μg/mL。

综上所述，一定剂量的TFG可抑制U266细胞活性并诱导其凋亡，可能同细胞周期的捕获和细胞凋亡的诱导相关，待进一步研究作用机制及动物实验后，可为研究和开发TFG 作为抗多发性骨髓瘤的天然药物提供了理论基础。