普鲁卡因通过抑制JAK2/STAT3通路缓解神经病理性疼痛

李东华 田英刚 段 勇

滨州医学院附属医院神经内科 山东 滨州 256603

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是由躯体感觉系统的病变所引起的，常常伴有外周神经功能和中枢神经系统功能的变化[1]。目前发现，NPP多发于中老年人和癌症患者，已经成为全球的负担[2]。NPP包括阴性和阳性感觉症状。前者表现为不同体表感觉的缺失，如感觉迟钝，麻木和振动感丧失；后者表现为痛觉过敏，阵发性疼痛和持续性表面疼痛等[3]。据报道， NPP的治疗效果较差，严重影响了患者的生活质量，是导致慢性疼痛的主要因素。近年来，医学界对NPP的分子学治疗的研究逐渐深入[4]，这对治疗NPP具有十分重要的意义。

普鲁卡因是临床工作中广泛使用的一种酯类局部麻醉药。近年来，有研究证实普鲁卡因具有治疗疾病的作用，例如，在正中神经周围注射4 mL 1%的普鲁卡因可改善腕管综合征患者的电生理指标和临床症状[5]。亦有研究证实，普鲁卡因能通过调节各种细胞凋亡途径，进而来治疗膀胱癌，因此可作为治疗膀胱癌的潜在药物[6]。其新功能引起了医学界的关注。因此，本实验旨在研究普鲁卡因是否具有缓解NPP的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 热辐射刺痛仪、电子触觉测量仪购于美国。质粒载体pcDNA3.1、TRIzol总RNA抽提试剂购于美国。第一链cDNA合成试剂盒购于大连TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 随机把18只体质量为180～210 g的SD雌性大鼠分为对照组、CCI组和CCI+普鲁卡因组，平均每组6只，其中对照组不做双侧大鼠坐骨神经压迫模型(chronic constriction，CCI)手术，CCI组和CCI+普鲁卡因组大鼠均需做CCI手术。分别在手术前3天，手术1天和手术前为CCI +普鲁卡因组大鼠鞘内注射2%的盐酸普鲁卡因，剂量均为10 μL/kg，溶剂为DSMO。注射时间均为上午9时。而对照组和CCI组大鼠则鞘内给予等容量DSMO。

1.2.2 动物模型的建立 参照Bennet等[7]的方法建立CCI大鼠模型。所有大鼠给予戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉，然后消毒、铺巾，用4.0铬肠线在大鼠坐骨神经起始部上方2 mm处进行结扎。对侧同样操作。

1.2.3 疼痛行为学观察 术后第0、5、10、15、20天(20∶00)分别对三组大鼠进行监测，观察其对热刺激、机械刺激及冷刺激的疼痛行为学评分。

1.2.3.1 测定机械刺激缩足反射阈值 参靠Vivancos等[8]的办法，用von Frey电子测痛仪测量大鼠机械刺激缩足反射阈值。用金属探针垂直刺激大鼠双侧后足跟，使其3秒钟内出现快速缩足或舔足等反应。每只大鼠被重复检测3次。取其平均数，将之定为机械刺激缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT),三组均于普鲁卡因预处理前进行测定。

1.2.3.2 测定热刺激缩足反射潜伏期 参考Hargreaves等[9]的办法，用辐射热测痛仪垂直照射大鼠两后足底 ,大鼠出现快速退缩或舔足等动作时停止,将持续照射的时间称为缩足反射潜伏期 。每侧测3次，取平均值，定之为热刺激缩足反射潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)。三组均在普鲁卡因预处理前测定。

1.2.3.3 测定冷刺激缩足反射阈值 参考Datta等[10]的办法，在大鼠后足跟处滴丙酮0.1 mL，如其出现快速缩足或舔足等反应表示阳性，每侧测3次。记录每分钟出现阳性反应的次数，取平均值将之定为冷刺激缩足反射阈值。

1.2.4 取材 术后20天行为学检查后，将大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)实施麻醉，然后处死。取其L4-L6脊髓背角，并在液氮中迅速冷冻后提取RNA和蛋白质。

1.2.5 qRT-PCR检测JAK2和STAT3的mRNA表达 参照说明书，由TRIzol从组织中提取总RNA。用DNase I纯化RNA以除去DNA污染物。 在Quant-Studio 6 Flex实时PCR系统上进行qRT-PCR(每个反应系统包含20 ng cDNA和大鼠Jak2和Stat3的特异性引物)。数据通过Gapdh和Rv标准化，并用2-ΔΔCt方法分析。

1.2.6 western blot检测JAK2和STAT3的表达 参照说明书，通过RIPA裂解缓冲液从组织中提取蛋白质样品。在凝胶电泳上分离相同量的每种样品的蛋白质，然后转膜。于室温下将膜在5%脱脂乳中封闭2 h，并在4℃下在JAK2，STAT3和GAPDH的特异性抗体中孵育过夜，GAPDH被用作内参。然后将膜在磷酸盐缓冲盐水中洗涤2次，并在辣根过氧化物酶缀合的二次抗体中在室温下孵育1 h。使用ECL Plus Western Blotting底物开发信号，并用ImageJ 1.49分析条带密度。

2 结果

2.1 坐骨神经压迫损伤和普鲁卡因对大鼠疼痛评分的影响 CCI术前，本实验检测到各组动物两侧后足的PWTL、MWT及冷刺激缩足反射阈值比较，差异无统计学意义。因此本研究对其平均值进行分析。结果显示：从术后第10天开始，CCI组与对照组大鼠的MWT差异有统计学意义，P<0.05；CCI组大鼠在术后第10、15天的MWT低于CCI+普鲁卡因组大鼠，P<0.05(图1A)；CCI组大鼠在术后第15天的PWTL最低，在术后第5天开始低于对照组，P<0.01；CCI组大鼠PWTL在术后第15、20天均低于CCI+普鲁卡因组大鼠，P<0.01(图1B)；在CCI术后的第5、10、15天，CCI组大鼠冷刺激阳性反应次数均明显高于对照组，P<0.01，在第5天最明显；相比于CCI组，CCI+普鲁卡因组大鼠在CCI术后第15天的冷刺激缩足反射阈值均有明显降低，P<0.05(图1C)。

2.2 坐骨神经压迫损伤和普鲁卡因对大鼠目的基因和蛋白的影响

2.2.1 qRT-PCR结果

2.2.1.1 总RNA的质量鉴定结果 分别提取三组大鼠的脊髓背角总RNA，进行测定OD260/OD280，其结果均为1.8～2.0，电泳结果显示：18和28 s处 RNA条带清晰，且18 s处的条带亮度约为28 s处条带亮度的2倍(图2)，由此说明提取的总RNA较为完整，可以进行qRT-PCR。

2.2.1.2 目的基因熔解曲线 将 GAPDH 作内参来进行qRT-PCR的扩增，而后检测各个样品孔熔解曲线。检测结果显示每个产物曲线均呈特异性单峰，表示无其他特异性产物。

2.2.2 坐骨神经压迫损伤和普鲁卡因对大鼠目的基因的影响 CCI术后第20天对各组大鼠分别进行取材，测JAK2 mRNA和STAT3 mRNA，其结果显示：与对照组比较，CCI组大鼠均明显较高，P<0.05或<0.01；同样，与CCI+普鲁卡因组比较，CCI组测得的JAK2 mRNA和STAT3 mRNA亦明显较高，P<0.05，见图3、4。

2.2.3 坐骨神经压迫损伤及普鲁卡因对大鼠目的蛋白表达的影响 CCI术后20天对各组大鼠分别进行取材，测得JAK2和STAT3的蛋白浓度，结果显示：CCI组大鼠的JAK2和STAT3的蛋白浓度明显高于对照组，P<0.01；而CCI+普鲁卡因组亦同样低于CCI组，P<0.01，见图5。

3 讨论

本研究中，CCI组大鼠表现出了比对照组更为敏感的疼痛行为学反应，同时测得其脊髓背角的JAK2以及STAT3的mRNA和蛋白水平均升高，这提示了在CCI诱发大鼠NPP的过程中激活了JAK2/STAT3信号通路，这也是产生NPP的原因。JAK/STAT信号通路和MAPK传导系统是神经细胞因子如白细胞介素-6的重要信号转导途径，并且几乎所有作用JAK的细胞因子均可激活JAK2/STAT3信号通路[11]。外周神经损伤引起了STAT3的磷酸化，导致了JAK2/STAT3信号通路被激活，进而引起了NPP[12]。对脊髓损伤大鼠的研究，发现JAK/STAT3抑制剂可诱导脊髓背角星形胶质细胞少量增生，并可促进触觉性异常性疼痛的恢复[13]。此外，有研究证实脊髓IL-33/ST2信号可通过激活JAK2/STAT3信号通路使NPP加剧[14]。 WP1066是STAT3的信号传导抑制剂，其可缓解CCI大鼠的疼痛行为，因此可做为治疗NPP的药物[15]。基于这些参考文献，我们可以看出JAK2/STAT3信号通路在外周和脊髓神经损伤中均能被激活，而抑制其信号传导则可减轻NPP。

普鲁卡因可抑制钠离子通道的开放，阻滞钠离子内流，从而阻断了疼痛信号的传递。同时，它还可以抑制Ca2+通道的开放，这也是其产生局部麻醉的机制[16]。其缓解疼痛的作用激发了我们对普鲁卡因是否可以治疗NPP的设想。本实验结果表明：CCI诱导的NPP模型大鼠用普鲁卡因预处理可以缓解其机械、热和冷刺激下的疼痛行为。CCI手术诱导周围神经损伤，并且在脊髓水平上可检测到其影响结果，如JAK2和STAT3在基因水平及蛋白水平均有明显升高。在此基础上，鞘内注射普鲁卡因可缓解大鼠的疼痛行为，降低了JAK2和STAT3的水平，说明抑制了JAK2/STAT3的信号传导，提示普鲁卡因可有效缓解NPP。

综上所述，本研究揭示了普鲁卡因在CCI诱导的NPP模型大鼠中有减轻NPP的新作用，表明普鲁卡因是治疗NPP的潜在药物。普鲁卡因的这种新作用可能与抑制了JAK2/STAT3的信号传导有关，但是其详细机制仍有待于进一步的研究。