转染pre-hsa-miR-98对BV-2细胞活化和凋亡的影响

霍颖倩 衣香明 贾 瑞

滨州医学院附属医院神经内科 山东 滨州 256603

文献证明，脑组织缺血或出血等局部微环境的变化，会导致microRNA表达异常，引起相关靶基因表达异常。miR-98在许多组织内均有表达，但miR-98在脑组织内的表达及调控鲜见报道。脑缺血损伤早期，小胶质细胞活化可发挥一定的神经保护作用，但小胶质细胞过度活化后可产生一系列炎症因子或介质介导神经元退行性变。因此，研究者应尽量诱导小胶质细胞发挥神经保护作用，限制小胶质细胞过度活化导致的神经毒性作用[1]。因此，抑制小胶质细胞过度活化、调控细胞表面或细胞内表达的受体或蛋白分子、拮抗其产生的神经毒性因子、促进小胶质细胞分泌神经保护性物质、阻断小胶质细胞介导的炎症反应等，将为脑缺血治疗提供新思路。我们采用pre-hsa-miR-98转染BV-2细胞，观察了转染后对细胞活化调控及调亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 Pre-hsa-miR98质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR购自广州复能基因有限公司；质粒提取试剂盒购自Biomiga公司；RPMI1640培养液购自Hyclone公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)购自Amresco公司。一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)，购自碧云天生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 BV-2细胞培养参见文献[2]

1.2.2 HmiR和CmiR质粒扩增和提取 HmiR(货号: HmiR0378MR04)为非病毒性载体, 启动子为巨细胞病毒 (cytomegalovirus, CMV)，具有嘌吟霉素抗性，报告基因eGFP，连接hsa-miR-98前体序列、载体构建图谱及转染方法，见文献[3]。

1.2.3 质粒转染 转染前1d将BV-2细胞接种于6孔板,严格按照 Lipofectamine 2000说明书介绍将质粒转染入细胞。实验分为空白对照组、HmiR组和CmiR组。

1.2.4 转染率检测、细胞计数及增殖率检测 倒置荧光显微镜检测转染率，MTT法检测细胞增殖率，详细步骤及操作方法见文献[3]。

1.2.5 细胞凋亡检测 严格按检测试剂盒说明操作。主要步骤：收集细胞，PBS洗涤。在侧摆摇床上缓慢摇动的同时，用免疫染色固定液(P0098)固定细胞30 min。PBS洗涤，免疫染色强力通透液(P0097)重悬细胞，室温孵育5 min。加入50 μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min。PBS洗2次。PBS悬浮，荧光显微镜下计数凋亡细胞。实验重复2次。

2 结果

2.1 转染率检测结果 荧光显微镜下显示，质粒带绿色荧光蛋白，转染细胞后表达绿色荧光，见图1。计数荧光细胞占细胞总数百分比计算转染率，转染率结果见图2。荧光显微镜计数和流式细胞仪计数分析显示，实验组和对照组的转染率比较差异无统计学意义，提示该质粒可以用于本实验。

2.2 细胞增殖率检测结果 转染48 h后, 实验组细胞增殖率同转染24 h组比较略微降低，但差异无统计学意义，转染72 h后, 细胞增殖率达到最低。转染72 h后各组细胞之间的增殖率同转染24 h相比明显降低，P<0.05，见图3。这提示，转染后随着时间的增加，细胞抑制增殖作用有可能稍微增加。

2.3 细胞凋亡检测结果 见图4、5。考虑到转染质粒带有绿色荧光，本实验采用的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒带有红色荧光，可以用于转染后的细胞凋亡检测。检测各组细胞凋亡率见图5。结果显示，转染后24 h，组间细胞凋亡率比较，差异无统计学意义；转染后48 h，各组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义；转染后72 h，实验组细胞凋亡率同空白对照组细胞相比有所增加，但差异无统计学意义。我们的研究发现，HniR、CmiR转染至正常的BV-2并未导致明显地凋亡诱导作用，因而可以用于后续研究。

3 讨论

miR-98作为miRNA的一种, 研究表明其在肿瘤形成过程中发挥作用。Sukata等[4]研究发现, miR-98与大鼠肝癌形成过程有关。另有文献报道，miR-98在许多肿瘤中表达失调,如Yan等[5]研究发现乳腺癌中hsa-miR-98上调。有研究提出几种可能的miR-98靶基因，如Du等[6]在肺癌研究中发现，miR-98可下调抑癌基因FUS1的表达。小胶质细胞是颅内肿瘤，特别是脑胶质瘤发生发展的重要组成部分，研究miR-98对小胶质细胞活化的影响，有助于理解小胶质细胞对脑内微环境变化应答的调控机制，并由此发现脑胶质瘤的可能治疗靶点。

为探讨miR-98对小胶质细胞表达的影响，我们利用构建的pre-hsa-miR98质粒转染鼠BV-2小胶质细胞系，初步研究了其转染率和抑制细胞增殖作用。研究发现，pre-hsa-miR-98质粒能成功地转染BV-2细胞，并在转染后调控miR-98表达。如前所述，miR-98在一些肿瘤中表达，并能抑制许多种肿瘤细胞的增殖和生长[3]。考虑到本研究如果在转染后miR-98表达抑制BV-2细胞的增殖和生长，可能会影响后续的研究，我们观察了pre-hsa-miR-98质粒成功转染BV-2细胞后对细胞增殖和生长的影响。研究证实，pre-hsa-miR-98质粒转染BV-2细胞未明显地抑制其增殖和生长，可用于后续研究。

文献报道，miR-98表达可以抑制许多肿瘤细胞增殖并诱导凋亡[7]。为了保证本研究的后续实验，我们检测了BV-2细胞转染该质粒后的细胞凋亡率。结果显示，mir-98转染并未明显诱导BV-2细胞凋亡。我们推测，可能因为本研究采用的是正常细胞系，而正常细胞中的相关癌基因未被激活或者抑癌基因正常发挥作用，因而未明显诱导细胞凋亡。这一结果值得继续研究，以深入了解miR-98的作用。另外，本研究采用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，有效地避免了质粒中绿色荧光的干扰，提高了检测结果的可靠性和敏感性。

最近有报道，miR-98可以减轻心脏缺血-再灌注导致的内皮细胞损伤[8]。在缺血-再灌注中风鼠模型，miR-98通过保护血脑屏障降低内皮功能异常，改进神经病学结果[9]。这些文献报道为我们进一步研究miR-98在小胶质细胞中的作用，提供了依据。

本研究为深入研究小胶质细胞功能及其在脑卒中和阿尔茨海默症等发病及进展中的作用提供了实验依据。