高效凝胶过滤色谱法测定菊糖聚合度

李玲玉，李雨晨，左兆河，田宝兰，郑振佳*

(1. 山东农业大学 食品科学与工程学院 山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室, 山东 泰安 271018；2. 山东医药技师学院，山东 泰安 271000；3. 山东植益源健康科技有限公司，山东 泰安 271000)

菊糖(inulin)是一种直链结构多糖，由D-呋喃果糖经β(2→1)糖苷键聚合而成，其还原端末端带有一分子葡萄糖，聚合度在2～60[1]。菊糖广泛分布于植物、微生物和真菌中，其中菊科和桔梗科植物中含量尤为丰富[2-4]。菊糖具有降血糖、降血脂、调节肠道菌群、抗癌等多种生理活性，同时也可作为天然质构剂应用于生产巧克力、奶酪、肉馅、面条等多种食品及菊糖系列保健品等诸多领域[5-9]。研究发现菊糖的生理活性和加工特性与菊糖聚合度密切相关。例如，Padalino等[10]发现与低聚合度的菊粉相比，在意大利面中添加高聚合度菊粉后，面条的总膳食纤维显著增加，有效碳水化合物和淀粉消化率含量降低；Luo等[11]发现高、中、低三种聚合度的菊粉均可以延缓淀粉的老化，但低聚合度菊粉效果最好。然而植物来源、收获季节、气候、土壤以及生产加工过程等各个因素均会对聚合度产生影响[12]。高效凝胶色谱法是利用凝胶粒径来排阻特定大小分子的方法，按照样品的分子量大小对其分级，大分子通过凝胶柱时被完全排阻在填料网孔之外先流出，小分子则穿过填料网孔溶剂中后流出[13]。该方法具有高效、快速、灵敏度高等特点，目前常被用于研究多聚合物的相对分子量及分布的测定，逐渐应用于多糖、蛋白和树脂等多种聚合物中[14]。

本文建立了一套高效凝胶过滤色谱测定相对分子量的方法，将系列不同分子量的葡聚糖样品配制后，进入高效凝胶色谱系统，将测得的响应值和出峰时间的谱图用GPC软件处理，绘制分子量和出峰时间关系曲线，并且利用该方法对菊苣、菊芋和牛蒡三种批次农产品提取的菊糖分子量进行检测。本研究为天然菊糖活性研究及菊糖产业化生产与市场开发奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，配有四元泵、示差检测器(refraction index detector-10A，RID-10A)、柱温箱、自动进样器等；SCIENTZ-12N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

OHpak SB-802.5 HQ色谱柱(8 mm×300 mm，6 μm，日本Shodex公司)。

葡聚糖(342 D、1000 D，2000 D，5000 D，6000 D，试剂纯，上海源叶生物公司)；无水乙醇、苯酚、正丁醇、硝酸钠、氯仿等(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；浓硫酸(优级纯，济南试剂总厂)；果糖(优级纯，北京索莱宝科技有限公司)；实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 实验材料

菊芋、菊苣和牛蒡的干切片，分别编号为a、b、c，其中菊芋a-1、a-2和a-3产地分别为江苏徐州、河北衡水和福建宁化；菊苣b-1、b-2和b-3产地均为吉林长白山；牛蒡c-1、c-2和c-3分别为江苏徐州的白肌、柳川理想和山东临沂的黑皮牛蒡。

2 方法与结果

2.1 菊糖样品制备

2.2 菊糖质量分数的测定

以果糖为标准对照糖，采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖质量分数[17-19]。以果糖浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度OD490nm为纵坐标，绘制果糖标准曲线。标准曲线为Y=0.007 4X-0.002 3,R2=0.999 4，糖浓度在20～100 μg/mL时与吸光度具有良好的线性关系。

2.3 分子量的测定

参照李琬聪等[20]和Chen等[21]的方法测定菊糖分子量。

2.3.1 高效液相色谱条件

色谱柱：凝胶色谱柱OHpak SB-802.5 HQ (8 mm×300 mm，6 μm)；示差折光检测器：RID-10A；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；流动相0.3 mol/L硝酸钠溶液和水，以0.3 mL/min的流速对菊糖样品c-1进行分析，液相色谱图见图1。

图1 c-1样品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatography of c-1

2.3.2 标准曲线的拟合

本研究考察了一次方程到五次方程的拟合形式，用标准曲线的R2值为衡量标准。依据2.3.1高效液相色谱条件进样，分别配制5.0 mg/mL的葡聚糖(分子量为6000 D、4000 D、2000 D、1000 D和342 D)，并用0.22 μm的水系滤头过滤，拟合标准曲线为Y=-0.001 718 157X3+0.1 504 561X2-4.498 484X+48.71 874，R2=0.999 9，见图2。

图2 不同分子量糖标准曲线Fig.2 Standard curve of dextran with different molecular weights

2.3.3 菊糖聚合度测定

将样品配制为5.0 mg/mL，使用0.22 μm的水系滤头过滤。按照标准样品的条件进样，获得样品的出峰时间和强度分布图，将该结果带入GPC软件拟合的标准曲线中计算菊糖相对分子质量，进而检测菊糖聚合度。

2.4 方法学考察

2.4.1 准确性

取葡聚糖对照品(342 D、2000 D和6000 D)各3份，按照1.3.3的处理方法，重复进样3次，将GPC软件计算得到的相对分子质量与已知标准分子质量的葡聚糖为对照，利用相对误差衡量标准曲线的准确度。将保留时间带入GPC软件拟合的标准曲线中，可得葡聚糖对照品(342 D)的相对分子量分别为342 D、343 D和344 D，相对误差分别为0、0.29%和0.58%；葡聚糖对照品(2000 D)的分子量分别为1989 D、1993 D和2003 D，相对误差分别为0.55%、0.35%和0.15%；葡聚糖对照品(6000 D)的分子量分别为5972 D、6013 D和6044 D，相对误差分别为0.47%、0.22%和0.73%，说明该葡聚糖对照品准确度较好。

2.4.2 重复性

取多糖样品(a-1、b-2和c-3)各3份，按照1.3.3的处理方法，重复进样3次，将测得的3组菊糖保留时间代入标准曲线，分别计算三种样品重均分子量的相对标准偏差。根据GPC软件计算得到多糖样品的重均分子量。其中a-1的相对分子量为1762 D、1786 D和1791 D，平均值为1 780 D，相对标准偏差为0.87%；b-2为3992 D、4000 D和3996 D，平均值为3996 D，相对标准偏差为0.01%；c-3为2290 D、2296 D和2294 D，平均值为2293 D，相对标准偏差为0.13%，说明重复性良好。

2.5 数据处理

本实验采用GPC软件计算多糖的平均分子量Mw，重复3次，并按照公式(Mw=162 DP+18)[22]，计算菊糖聚合度。利用Excel 2016 和Origin 9.0进行数据处理。

采用建立的测定方法分别分析了9批植物样品的多糖质量分数和相对分子量，并计算得到9批样品的聚合度，结果见表1。结果显示，本次选取的9个样品的菊糖聚合度在10～29，不同品种，同一品种不同批次菊糖聚合度均有不同程度的差异。

表1 菊糖聚合度及多糖质量分数Table 1 Inulin polysaccharide content and polymerization degree

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 流动相的选择

从图1中 c-1样品分子量液相图可以看出，以0.3 mol/L硝酸钠溶液(a)和纯水作流动相(b)出峰时间和响应值差别不大，峰面积的相对标准偏差控制在10%以内(相对标准偏差为9.41%)，但前者作流动相测定菊糖分子量基线更为平稳，后者会出现基线漂移，因此该方法选用0.3 mol/L硝酸钠溶液为流动相。

3.1.2 流速的选择

菊糖分析过程可通过降低流速实现提高分离效果的目的，同时流速的降低也会使峰宽增大造成保留时间变长[23]。该色谱柱在盐浓度0.2～0.5 mol/L时，置换流量为0.3 mL/min，该流速下目标组分分离效果较好，因此选择0.3 mL/min的流速为分析流速。

3.1.3 标准曲线拟合形式的选择

分别考察了一次到五次方程拟合的标准曲线，结果显示三次方程拟合的标准曲线拟合度最好，满足分析要求，相关系数R2>0.999，其他幂次拟合的方程R2值低于0.98，可行性低于三次方程拟合，因此选择三次方程拟合标准曲线。

3.2 结论

本研究建立了一套菊糖分子量的检测方法，其中色谱柱为OHpak SB-802.5 HQ，进样量为20 μL，温度30℃，流动相为0.3 mol/L硝酸钠溶液，流速为0.3 mL/min，利用GPC 软件绘制三次标准曲线及计算分子量。本研究从3种菊科植物3个批次提取的菊糖分子量检测结果看，9个样品聚合度有不同程度的差异，不同品种及同一品种不同批次即使在提取条件完全相同时菊糖的聚合度也会不同，同时本研究建立的方法的相对误差和相对标准偏差分别控制在0.73%和0.87%，准确性和重复性较好。该方法可以直接应用到菊糖实际生产中，为后期功能性菊糖的开发及品质控制、食品工业上菊糖作为添加剂的筛选、不同产地或不同品种菊科植物产品的开发、不同储藏期菊糖分子量的研究等提供新思路。