仿生提取法研究蚂蟥不同部位体外抗凝活性

王常瞵，刘国飞，向泽栋，董萍萍，赵红金，高鹏，代龙*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东禹泽药康产业技术研究院有限公司，山东 德州 251200)

水蛭是我国名贵中药材，为水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman、柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman和水蛭HirudonipponicaWhitman的干燥全体，具有破血通经、逐瘀消癥之功效[1]，临床多用于消散淤血，治疗心血管疾病、血栓性疾病等[2]。其中，蚂蟥又名宽体金线蛭，为山东省微山湖地区的道地药材，是当前药材市场流通和临床应用的主流品种[3]。

水蛭不同部位的抗凝活性具有一定的差异，研究表明水蛭素是从新鲜吸血水蛭唾液腺中分离纯化得到的[4]，而蚂蟥为非吸血水蛭，其药效部位与物质基础尚不明确，其抗凝的有效成分是否也存在于消化系统中有待验证，因此研究蚂蟥不同部位的抗凝活性具有重要意义。目前水蛭的抗凝活性研究中，研究者大多采用生理盐水提取，而水蛭的主要成分为蛋白质[5-6]，进入体内需经过胃肠道的消化降解后，才能吸收入血发挥疗效。因此生理盐水提取的成分与体内发挥疗效的活性成分可能完全不同。仿生提取模拟体内消化过程，能真实地反映水蛭在体内的代谢变化，所得活性成分与药效物质更为接近[7]。

本实验采用生理盐水提取和仿生提取法对蚂蟥肌肉、内脏、吊干品进行提取，以针对不同凝血途径的凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)以及抗凝血酶活性为指标测定其体外抗凝活性，并进行对比，深入研究蚂蟥不同部位的抗凝活性，为寻找蚂蟥的药效部位和物质基础提供科学的依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

Xi1000全自动凝血测试仪(北京众驰伟业科技发展有限公司)；H01-1A磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；PHS-25PH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；FD-1A-50冻干机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 实验材料

1.3 实验动物

SD大鼠 (济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号:SCXK (鲁) 2019-0003),雄性, 体重(200±5)g。

2 实验方法

2.1 实验取材

将活体蚂蟥用细绳穿起，置于阴凉通风处晾干，即为吊干品，粉碎，过5号筛，备用。将活体蚂蟥置于冰块上解剖，将内脏与肌肉分离开，冻干得到蚂蟥内脏与肌肉冻干粉，粉碎，过5号筛，备用。

2.2 活性成分的提取

2.2.1 生理盐水提取

取蚂蟥吊干品、肌肉、内脏粉末，加入10倍量生理盐水，充分搅拌，浸提30 min，时时振摇，4500 r/min离心10 min，取上清液作为供试品溶液。

2.2.2 仿生提取

取蚂蟥吊干品、肌肉、内脏粉末，加入10倍量水，称重，85 ℃加热15 min后补足失重，冷却至40 ℃，用稀盐酸将pH调至2.0，加入酶底比为1%的胃蛋白酶，酶解1 h，用氢氧化钠将pH调节至8.0，加入酶底比为1%的胰蛋白酶，酶解3 h，85 ℃加热15 min杀酶，然后将酶解液pH调至7.0，4500 r/min离心10 min，得上清液，沉淀加水洗涤2～3次后4500 r/min离心10 min，得上清液，将所得上清液合并，定容至药材10倍量体积，作为供试品溶液[8]。

2.3 体外抗凝活性的测定

TT、APTT、PT是反映血液凝固时间的代表性指标，分别体现了三个不同凝血途径的凝血时间，能够用来全面地反映药物的抗凝活力。抗凝血酶活性测定即凝血酶滴定法，为2015年版《中国药典》水蛭药材项下的测定指标。

2.3.1 贫血小板血浆(PPP)的制备

2.3.2 凝血酶时间的测定

取270 μL PPP和150 μL 供试品溶液混匀，作为待测血浆，吸取100 μL 待测血浆于测试杯中，37 ℃孵育3 min后，加入100 μL TT试剂，记录凝固时间，同时以空白溶液为参比溶液。生理盐水提取样品以生理盐水为空白溶液，仿生酶解提取样品以空白酶解液为空白溶液。空白酶解液按2.2.2项下仿生提取所述，除不加蚂蟥粉末外，其余步骤均相同。

2.3.3 活化部分凝血活酶时间的测定

取300 μL PPP和120 μL 供试品溶液混匀，作为待测血浆，吸取50 μL 待测血浆和50 μL APTT试剂于测试杯中，混匀，37 ℃孵育3 min，加入CaCl2溶液50 μL ，记录凝固时间，同时以空白溶液为参比溶液。

2.3.4 凝血酶原时间的测定

取300 μL PPP和120 μL 供试品溶液混匀，作为待测血浆，吸取50 μL 待测血浆于测试杯中，混匀，37℃孵育3 min，加入PT试剂100 μL ，记录凝固时间，同时以空白溶液为参比溶液。

2.3.5 抗凝血酶活性的测定

精密量取供试品溶液100 μL置于试管中，加入含有0.5%纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200 μL，摇匀，置37 ℃水浴中温浸5 min，滴加每1 mL中含10单位的凝血酶溶液(每4 min滴加1次，每次2 μL，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液体积，计算抗凝血酶活性。

3 实验结果与分析

3.1 凝血酶时间

蚂蟥不同部位生理盐水提取物和仿生提取物的TT值见表1。

表1 蚂蟥不同部位生理盐水提取物及仿生提取物TT值(n=5)Table 1 TT indicator for saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n=5) 单位：s

在TT所反映的凝血共同途径中，无论生理盐水提取还是仿生提取，与空白组相比，蚂蟥各部位均能产生较强的抗凝活性(p<0.05)，但是在不同部位抗凝活性对比时，不同提取方法具有一定的差异。采用生理盐水提取时，内脏的TT值明显高于肌肉和吊干品(p<0.05)，表明内脏的抗凝活性大于肌肉和吊干品，这与吴曼郡等[9]的研究结论一致，推测可能蚂蟥内脏中也存在水蛭素类似物，能够很好地抑制凝血酶的活力。而在仿生提取时，内脏的抗凝活性较肌肉与吊干品有明显的降低(p<0.05)，可能是由于水蛭素等抗凝大分子物质被降解为小分子，抑制凝血酶的分子及空间结构被破坏，导致抗凝活性降低。吊干品和肌肉在仿生提取时的抗凝活性高于生理盐水提取，是由于仿生酶解将吊干品和肌肉中的大分子蛋白降解为小分子物质，暴露了其中的抗凝活性位点，使其具有一定的抗凝活性。

3.2 活化部分凝血活酶时间

蚂蟥不同部位生理盐水提取物和仿生提取物的APTT值见表2。

表2 蚂蟥不同部位生理盐水提取物及仿生提取物APTT值(n=5)Table 2 APTT indicator for saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n=5) 单位：s

在APTT所反映的内源性途径中，结果显示蚂蟥各部位仿生提取液的抗凝活性均高于生理盐水提取液。生理盐水提取法结果显示，蚂蟥的内脏与肌肉和吊干品相比，能够显著延长APTT(p<0.05)，这与TT法的测定结果一致，这也进一步证实了蚂蟥内脏中确实存在较强的抗凝活性物质，能够延长TT和APTT。仿生提取法结果显示，与TT所得到的结果不同，蚂蟥内脏APTT值较高(p<0.05)，可能是由于内脏中的大分子蛋白质被降解为肽类物质，但其中的抗凝氨基酸序列依然存在，对凝血因子Ⅺ、Ⅻ等具有较强的抑制作用，从而起到延长APTT的作用。

3.3 凝血酶原时间

蚂蟥不同部位生理盐水提取物和仿生提取物的PT值见表3。

表3 蚂蟥不同部位生理盐水提取物及仿生提取物PT值(n=5)Table 3 PT indicator for saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n=5) 单位：s

在PT所反映的外源性途径中，无论生理盐水提取还是仿生提取，内脏、肌肉、吊干品间的差异均较小(p>0.05)，这与苏斌[10]的研究结果相一致，表明PT指标在蚂蟥体外抗凝活性检测方面的敏感性较TT和APTT差，只有样品在较高浓度时才能延长PT。

3.4 抗凝血酶活性

蚂蟥不同部位生理盐水提取物和仿生提取物的抗凝血酶活性见表4。

表4 蚂蟥不同部位生理盐水提取物及仿生提取物抗凝血酶活性(n=3)Table 4 Antithrombin activity of saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n = 3)

生理盐水提取结果显示蚂蟥内脏、肌肉、吊干品三者的抗凝血酶活性相同。仿生提取结果显示，内脏的抗凝血酶活性比吊干品和肌肉的抗凝血酶活性低，这与TT法得到的结果相吻合。

同时仿生提取法的抗凝血酶活性均大于生理盐水提取，这表明蚂蟥在仿生酶解后抗凝活性显著增强。凝血酶滴定法反映的是可溶的纤维蛋白原在凝血酶的催化作用下向不溶的纤维蛋白转化的过程，其凝血途径与TT法类似，但是由于需要滴加过量的凝血酶才能使纤维蛋白原凝固，对于效价相近的药材，在最后一次凝血酶滴加之后，有的在很短时间内就能凝固，而有的需要较长时间凝固，这表明药材的抗凝血酶活性是不同的，而实验人员却认为二者抗凝血酶活性是相同的，导致实验准确度和灵敏度不足。

4 结论

本文研究了蚂蟥不同部位在生理盐水提取和仿生提取两种方法下的体外抗凝活性，由于两种提取方法得到的活性物质不同，导致体外抗凝活性具有一定的差异。采用生理盐水提取时，在反映凝血共同途径的TT值和反映凝血内源性途径的APTT值中，内脏均大于肌肉和吊干品，推测蚂蟥的消化系统中也存在与吸血水蛭类似的水蛭素类物质，具有较强的抗凝活性，而在反映凝血外源性途径的PT值中，三者间没有显著性差异。采用仿生提取时，在TT值和抗凝血酶活性实验中，内脏的抗凝活性低于肌肉和吊干品，是由于胃蛋白酶和胰蛋白酶破坏了水蛭素类物质的分子结构和空间结构，使得凝血酶直接抑制剂——水蛭素类物质无法与凝血酶结合发挥抗凝活性，而蚂蟥肌肉和吊干品由于酶解，暴露出其中的活性位点，具有较强的抗凝活性。在反映凝血内源性途径的APTT值中，内脏与肌肉和吊干品相比，具有较强的抗凝活性，在反映凝血外源性途径的PT值中，各部位抗凝活性没有显著性差异。由于仿生提取法模拟了体内消化过程，相比传统的生理盐水提取具有更高的可信度。

由上述研究可知蚂蟥各部位针对不同的凝血途径，其抗凝活性具有一定的差异，抗凝物质基础较为分散，不仅存在于消化系统中，肌肉也具有很强的抗凝活性，该研究为寻找蚂蟥的物质基础和药效部位提供了依据。