基于网络药理学研究厚朴-杏仁治疗哮喘的潜在作用机制

李焕敏，李新民，孙丹，韩耀巍，孙婷，律扬，陈鸿祥

(天津中医药大学第一附属医院，天津 300381)

哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应为特征的异质性疾病，临床以反复发作的喘息、咳嗽、气促、胸闷等症状为主要表现，常在夜间和/或凌晨发作或加剧。调查显示，1990—2015年哮喘的患病率增加12.6%，占据1.1%的全球疾病负担[1]。哮喘的治疗主要通过吸入糖皮质激素和β2受体激动剂[2]，二者虽对哮喘的急性发作具有重要控制作用，然而缓解期激素类药物的长期使用，容易出现副作用，尤其影响儿童患者的生长发育。中医药治疗哮喘经验丰富，很多证据表明其在治疗哮喘时安全有效[3]，不仅可以缓解哮喘发作，还能从整体调节患者体质，增强患者抗病能力，副作用小，故常被单独或联合用于哮喘缓解期的治疗。

《伤寒论》第18条记载“喘家作桂枝汤，加厚朴杏子佳”，指出桂枝加厚朴杏子汤可治疗宿有喘病，又感风寒而见桂枝汤证者，或风寒表证误用下剂后，表证未解而微喘者。方中厚朴驱除痰涎，疏利气雍，杏仁定喘镇咳，两者相佐以下气逆，常被临床医家应用于哮喘及咳嗽伴喘息发作等疾病的治疗[4-5]。现代研究表明，厚朴的有效成分厚朴酚能降低哮喘小鼠VEGF的表达，延缓气道重构的发生[6]；杏仁的有效成份苦杏仁苷能有效减轻支气管哮喘小鼠气管黏膜下层炎性细胞浸润[7]。厚朴、杏仁在治疗哮喘时常配伍应用，现代药理学虽然对其在治疗哮喘中的有效成分有一定研究，但其协同治疗的作用机制尚不明确。网络药理学整体性、系统性的研究策略与中药在治疗疾病方面的多成分、多途径、多靶点的作用原理十分契合。本研究应用网络药理学方法，对厚朴、杏仁配伍应用在治疗哮喘中的作用途径和机制进行研究和探讨，以期为日后进一步实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 中药化学成分作用靶标及哮喘疾病相关靶标筛选

本研究中厚朴、杏仁的化学成分及靶标信息来自于中药分子机制生物信息学分析平台BATMAN-TCM[8](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。将收集整理后的靶点导入Uniprot数据库[9](https://www.uniprot.org/)列表并限定物种为人，所有靶基因名称校正为官方名称(official gene symbol)，并剔除没有靶点的活性成分。疾病靶标信息来源于PALM-IST数据库[10](http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/)。

1.2 韦恩分析及潜在靶标信息筛选

应用Draw Venn Diagram在线工具[11](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)对厚朴-杏仁(Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum)药物靶标与哮喘疾病靶标进行韦恩分析。

1.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建及可视化分析

采用string数据库[12](https://string-db.org/cgi/input.pl)对收集到的药物靶标构建蛋白质相互作用网络(protein protein interaction network, PPI network)，设置物种为“Homo sapiens”，设定最小相互作用得分(interaction score)>0.4进行操作，隐藏离散靶点。利用Cytoscape v3.5.1软件的在线工具Network Analyzer进行可视化参数设置，通过cetiscape 2.2插件进行连接度(degree)、介度(betweenness)、紧密度(closeness)分析，筛选关键靶标信息。

1.4 基因功能和通路富集分析

利用DAVID (the database for annotation, visualization and integrated discovery)数据库[13](https://david.ncifcrf.gov/)和Cytoscape v3.5.1软件的ClueGO+cluepedia插件对药物关键靶标进行GO(gene notology)生物功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路富集分析。

2 结果

2.1 厚朴-杏仁药物靶标与疾病靶标检测结果

通过BATMAN-TCM数据库对厚朴、杏仁的化合物和靶标信息进行检索，设置筛选标准Score cutoff大于等于40，P≤0.05，剔除不含靶标的化合物，分别找到厚朴、杏仁的化合物38个、16个；靶标353个、186个。剔除3个共有化合物及104个共有靶标，共收集到化合物51个(见表1)，靶标435个。通过PALM-IST数据库对疾病的靶标信息进行检索，以“asthma”作为搜索的关键词，筛选标准为 No. of article大于10，共找到疾病相关靶标415个。

表1 厚朴-杏仁治疗哮喘的药物有效成分基本信息Table 1 Basic information of effective ingredients of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.2 厚朴-杏仁治疗哮喘的潜在靶标筛选

将厚朴-杏仁靶点与疾病靶点信息输入在线工具Draw Venn Diagram进行Venn分析，如图1所示，其中两组靶标重叠部分共有33个靶标，得到厚朴-杏仁治疗哮喘的潜在靶标，并用Uniprot数据库校正靶标名称和基因ID，如表2所示。

图1 厚朴-杏仁靶标与疾病靶标venn分析Fig.1 Target of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination and disease target by the Venn analysis

表2 厚朴-杏仁治疗哮喘的潜在靶标Table 2 Potential targets for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

续表2

2.3 厚朴-杏仁治疗哮喘的潜在靶标PPI网络构建

通过string数据库，对上述33个厚朴-杏仁治疗哮喘的潜在靶标进行PPI网络构建，其中“TYRP1”为离散靶点，以下分析中隐去。采用Cytoscape v3.5.1软件的在线工具Network Analyzer进行可视化参数设置，通过cetiscape 2.2插件选取连接度(degree)、介度(betweenness)、紧密度(closeness)并选择“for Undirected Networks”进行分析，筛选出厚朴-杏仁治疗哮喘的关键靶标14个，分别为ADRB2、CAT、ESR1、F2、IL13、IL1B、INS、MAPK1、PLG、PPARG、TLR4、TNF、TRPV1、VCAM1，如图2所示。图中靶标节点按degree值进行大小和颜色调节，节点越大颜色越深，表示degree值越高，其中黄色圆点为离散程度较大的靶标。degree值最高的靶标为肿瘤坏死因子(TNF)，Ying等[14]研究表明，哮喘患者支气管肺泡灌洗液中的TNF mRNA增加，提示TNF在哮喘的发病机制中起作用。

图2 厚朴-杏仁治疗哮喘潜在靶标PPI网络构建Fig.2 PPI network construction of the potential target for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.4 化合物-潜在靶标相互作用网络构建

利用Cytoscape v3.5.1软件对药物有效成分和厚朴-杏仁治疗哮喘的潜在靶标进行化合物-潜在靶标相互作用网络构建，如图3所示。网络图中红色圆形代表化合物，黄色椭圆形代表药物潜在靶点，一个节点的度(degree)表示网络中和节点相连的路线的条数，蓝色线条代表化合物与靶点之间的网络，紫色线条代表基因与基因之间的网络。化合物中花生四烯酸(arachidic acid，AA)有最多的潜在靶标(10个)，研究表明，花生四烯酸的代谢产物半胱氨酸白三烯(cysteinyl leukotrienes，Cys LTs)和脂氧酸(lipoxins，LXs)的不平衡状态在哮喘慢性炎症状态中起重要作用。

图3 化合物-潜在靶标网络图Fig.3 The compound-potential target network

2.5 厚朴-杏仁治疗哮喘关键靶标GO生物功能分析

利用DAVID数据库和Cytoscape v3.5.1软件的ClueGO+cluepedia插件对厚朴-杏仁治疗哮喘的关键靶标进行GO功能分析，其中GO基因功能分析包括生物学过程(biological process，BP)、细胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3部分，并从P<0.05的分析结果中筛选信息。

2.5.1 厚朴-杏仁治疗哮喘的生物学过程

厚朴-杏仁治疗哮喘的生物学过程(biological process，BP)主要涉及应激反应调控、先天性免疫反应调控、防御反应、急性炎症反应、刺激反应、凝血止血调节、自我内稳定、活性氧代谢过程、细胞死亡调控、细胞增殖、信号转导、细胞通讯、创伤修复、趋化因子产生、蛋白质代谢过程等生物过程，如表3所示。

表3 厚朴-杏仁治疗哮喘的生物学过程Table 3 Biological process of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.2 厚朴-杏仁治疗哮喘的细胞定位

厚朴-杏仁治疗哮喘的细胞定位(cellular component，CC)主要涉及胞外区及细胞外空隙，具体如表4所示。

表4 厚朴-杏仁治疗哮喘的细胞定位Table 4 Cellular component of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.3 厚朴-杏仁治疗哮喘的分子功能

厚朴-杏仁治疗哮喘的分子功能(molecular function，MF)主要涉及信号传感器活性、信号受体活性、受体活性、分子传感器活性、RNA聚合酶II转录因子活性，配体活化的序列特异性DNA结合及转录因子活性，直接配体调控序列特异性DNA结合等，如表5所示。

表5 厚朴-杏仁治疗哮喘的分子功能Table 5 Molecular function of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.6 厚朴-杏仁治疗哮喘关键靶标KEGG信号通路富集分析

利用DAVID数据库和Cytoscape v3.5.1软件的ClueGO+Cluepedia插件对厚朴-杏仁治疗哮喘的关键靶标进行KEGG信号通路富集分析，并从P<0.05的分析结果中筛选信息。

厚朴-杏仁治疗哮喘的关键靶标主要涉及NF-κB信号通路、IL-17信号通路、FcεRI信号通路、Toll受体信号通路及FoxO信号通路等，如表6所示。

表6 厚朴-杏仁治疗哮喘关键靶标KEGG信号通路Table 6 The KEGG signaling pathway of the key target of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

3 讨论

哮喘是一种慢性呼吸系统疾病，涉及多种细胞及细胞组分，临床表现以气道的慢性炎症、气道重塑和气道高反应为特征。尽管糖皮质激素和β2受体激动剂可有效控制哮喘症状，但长期使用容易出现副作用，因此仍缺乏治疗哮喘的有效方法。目前，在亚洲使用了数千年的传统中药开始在西方医疗保障中作为一种补充和替代医学的方式发挥作用，并且越来越多的证据表明中医药治疗哮喘的科学性[15]。哮喘之名出自《丹溪心法·喘论》，属于中医“哮证”“喘证”范畴，其病机为宿痰伏于肺，复感外邪引动，使痰阻气道、肺气上逆而致痰鸣如吼，气息喘促。厚朴-杏仁入药历史悠久，清朝汪昂《本草备药》中云：“厚朴，苦降能泻实满，辛温能散湿满；杏仁，泻肺、解肌、润燥、下气”，两者配伍应用“泻肺平喘，以降气逆”。本研究的GO基因功能和KEGG信号通路分析结果显示，厚朴-杏仁配伍可通过调节多种靶点、生物学途径和信号通路，在哮喘的气道炎症、气道重塑和气道高反应等方面发挥治疗作用。

3.1 厚朴-杏仁治疗哮喘具有调节多靶点、多途径的潜在作用

(1)调控炎症反应

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-13(IL-13)和白介素1β(IL1β)是引起哮喘气道炎症的重要介质。研究显示，TNF-α能够增强IL-23调节的Th2和Th17细胞免疫应答[16]，IL-13能够刺激B细胞的增殖、分化及IgE的合成，与肥大细胞、嗜酸性细胞相互作用，诱发哮喘的急性发作[17]，IL1β参与嗜酸性粒细胞的炎症过程[18]。这些介质协同作用于气道，引起多种炎症细胞的募集活化，促进气道黏液产生和平滑肌收缩，引起气道重塑和气道高反应。

(2)调控活性氧代谢

氧化应激损伤参与哮喘的发生发展过程，能够上调Th2细胞介导的炎症反应，增加哮喘的严重程度，促进气道高反应和气道重塑。过氧化氢酶(CAT)是一种重要的抗氧化酶，其遗传变异可通过促进细胞对抗活性氧，影响哮喘的发生过程[19]。

(3)调控信号转导

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是机体普遍表达的信号转导酶，几乎涉及哮喘炎症网络的所有方面，MAPK信号激活后能够加速细胞外信号传到细胞核内，促进炎性细胞因子生成，从而导致气道炎症[20]。

(4)调控受体活性

本研究的关键靶标中多种受体参与哮喘的发生。β2肾上腺素能受体(ADRB2)是G蛋白偶联肾上腺素受体家族成员之一，其基因的多态性与哮喘的易感性、哮喘恶化等方面具有相关性[21]。雌激素受体(ESR1)可能会导致哮喘患者的肺功能下降，尤其女性哮喘患者在月经期会出现哮喘症状加重[22]。胰岛素(INS)抵抗在肥胖相关的哮喘急性发作中起作用，可能与胰岛素信号受损，影响葡萄糖的摄入，从而影响抵抗细菌感染的气道代谢屏障有关[23]。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)是一种涉及多种细胞过程的配体激活转录因子，能够调节哮喘小鼠的气道高反应、炎症、细胞因子表达和组织重塑[24]。瞬时受体潜在阳离子通道亚家族V成员1(TRPV1)是调节CD4+细胞的激活和炎症特性重要介质，TRPV1抑制剂可减轻IL-13诱导的哮喘小鼠气道上皮损伤，从而降低哮喘特征[25-26]。激活的Toll样受体4(TLR4)可以直接或间接影响调节性T细胞的功能，从而影响Th1/Th2失衡，其基因多态性与哮喘的严重程度有关[27]。

(5)调控凝血止血功能

气道的慢性炎症可导致血管内皮细胞损伤，激活血小板和凝血因子，导致凝血功能紊乱。IL-6和较小程度的TNF-α介导的全身性炎症状态，可以驱动血浆中凝血酶原激活片段F1+2(F2)产生增强[28]。纤溶酶原(PLG)在炎性细胞迁移中起关键作用，参与哮喘早期支气管周围区域的胶原沉积和黏液化生，与组织重塑有关[29]。

3.2 厚朴-杏仁治疗哮喘具有调节多通路的潜在作用

(1)厚朴-杏仁具有调节FcεRI和NF-κB信号通路的潜在作用

肥大细胞介导的Ⅰ型过敏反应可导致哮喘的发生，抗原与IgE介导的FcεRI复合物交联激活肥大细胞，释放过敏介质及产生各种细胞因子(TNF-α、IL-1β等)，触发细胞内信号级联反应[30〗。NF-κB是FcεRI信号级联反应中的一个关键的转录因子，涉及多种炎症反应，通过调节细胞因子、趋化因子和细胞黏附分子的表达在气道病理学中起重要作用[31]。

(2)厚朴-杏仁具有调节Toll受体和IL-17信号通路的潜在作用

Toll样受体是介导免疫系统识别病原体的受体家族，病原体通过Toll样受体激活气道上皮的先天性免疫反应，并诱发气道炎症，从而导致哮喘急性加重。IL-17在哮喘小鼠模型中高表达，参与哮喘的气道炎症和氧化应激过程[32]。研究表明，IL-17A和TLR3通过TLR3/TRIF介导的NF-κB/IRF3激活，协同诱导上皮细胞中促炎因子和趋化因子的表达[33]。

(3)厚朴-杏仁可能具有调节FoxO信号通路的潜在作用

FoxO是一类对氧化还原敏感的重要转录因子，参与细胞周期调控、凋亡、氧化应激抵抗等生物学过程，但目前有关其在哮喘作用中的研究较少，可能与哮喘的氧化应激损伤相关。

气道的慢性炎症是导致哮喘发生的关键，这种慢性炎症对气道的损害进一步引起气道高反应和气道重塑，以上靶点和通路在哮喘气道炎症发病机制中起重要作用，也是厚朴-杏仁发挥治疗作用的关键。因此，厚朴-杏仁治疗哮喘具有多靶点、多途径、多通路的潜在作用。本研究基于网络药理学方法在一定程度上揭示了中医药治疗哮喘的科学内涵，但尚缺乏实验验证，可作为进一步实验研究的依据。