黄芪甲苷对尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎的防治作用及炎性反应机制研究

杨大兴 单延具 张欣亮 王雷

急性痛风发作是一种显著的炎性反应，通常出现在关节中。炎症过程是由周围组织中尿酸钠晶体的沉积引发的。临床上，痛风与关节的水肿、红斑以及严重的疼痛有关[1-3]。研究表明，尿酸钠的关节内注射引起的症状与临床痛风症状相似。尿酸钠的关节内注诱发关节肿胀，跛行和伤害感受行为，包括机械异常性疼痛和热痛觉过敏，并且还观察到中性粒细胞强烈浸润到关节间隙[4]。中性粒细胞在关节液和滑膜中积聚，产生促炎性介质，引发膜溶解。已经证明尿酸钠可以上调单核细胞/巨噬细胞中促炎蛋白，诱导炎性因子(IL-2、IL-6、TNF-α)的过表达。Toll样受体2(toll-like receptor 2，TLR2)在识别激动剂中起重要作用，如炎性产物等[5-7]。TLR2是参与信号转导的重要跨膜蛋白。核因子最终激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)转录因子是TLR2调控下的重要细胞因子，TLR2、NF-кB可调控炎性因子的激活。黄芪甲苷是从黄芪上提取出来的高纯度药物，黄芪多糖中的主要有效成份是多糖和黄芪苷[8,9]。黄芪甲苷可增强机体免疫力、提高机体的抗炎能力。研究发现，黄芪甲苷显著抑制脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞中的炎性因子iNOS和COX-2的表达，对角叉菜胶诱导的炎症和慢性收缩性损伤诱导的大鼠神经病变具有显着的抗伤害作用[10,11]。因此本研究拟重点探讨黄芪甲苷对尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎的防治机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及染毒 SPF级Wistar大鼠(250～300 g)120只，12周龄，体重250～300 g，重庆医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(渝)2018-0001]，将大鼠单笼圈养于有机玻璃笼中，并在温度(22±1)℃，自动控制昼夜循环(12/12 h)的条件下自由获得的食物和水。大鼠的使用经北京积水潭医院动物伦理委员会批准。尽量减少动物的痛苦并减少使用的动物数量。在该研究期间，每只大鼠仅使用1次。根据体重随机分成6组：对照组、模型组、秋水仙碱组(30.0 mg/kg)、黄芪甲苷低剂量组(10.0 mg/kg)、黄芪甲苷中剂量组(20.0 mg/kg)、黄芪甲苷高剂量组(40.0 mg/kg)，每组20只，雌雄各半。

1.2 药物、仪器及试剂 尿酸钠(美国Sigma公司，批号：170927)；秋水仙碱(广州亮化化工有限公司，CAS64-86-8，99.95%，批号：171218)，大鼠用药量为成人的20 倍；TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α Elisa试剂盒(上海樊克生物科技有限公司，批号：171123、180107、171220、171029、171025)；rizol RNA提取试剂和逆转录(RT)试剂盒(美国的Invitrogen公司，批号：AH4127)；TLR2、NF-кB RNA定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒(赛兰博、中国，批号：171208、171213)；LightCycler TePCR热循环仪(瑞士Roche公司)。

1.3 方法

1.3.1 尿酸钠溶液的制备：将1 g尿酸钠溶解在200 ml 含有6 ml 1 N NaOH的沸水中，再通过加入HCl的方法将最终溶液的pH值调节至7.2。将溶液冷却并在室温下搅拌，然后在5℃下储存过夜。从溶液中过滤出沉淀物，在低温下干燥并通过250-pm金属丝网筛分。 然后将尿酸盐晶体在10%吐温80的0.9%NaCl溶液中混合。在空气/O2混合物中用2.5%异氟烷麻醉。

1.3.2 6模型组的制备:对照组、模型组，每天给予腹腔注射0.9%氯化钠(3 ml/kg)，持续7 d；秋水仙碱组(30.0 mg/kg)、黄芪甲苷低剂量组(10.0 mg/kg)、黄芪甲苷中剂量组(20.0 mg/kg)、黄芪甲苷高剂量组(40.0 mg/kg)每天给予腹腔注射相应药物，持续7 d。模型组、秋水仙碱组、黄芪甲苷各剂量组将制备的尿酸钠注射到右踝关节中诱导急性痛风，对照组注射0.9%氯化钠溶液。试验结束后，进行大鼠关节炎症的积分(注射后6 h分别对6组大鼠进行评定关节炎症积分)

1.4 机械痛阈(paw withdrawl mechanical threshold，PWT)及热刺激潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)的测定 6组大鼠处死前，根据文献方法测定PWT、PWTL[12]。

1.5 TLR2、NF-кB在膝关节滑膜组织中表达的测定 使用Trizol Reagent从膝关节滑膜组织中提取总RNA。将750 μl TrizolLS试剂(Invitrogen)与250粉碎的膝关节滑膜组织混合。涡旋混合30 s后静置5 min，加入200 μl氯仿。将Trizol-氯仿混合物涡旋混合15 s，然后在4℃以12 000×g离心15 min。将上层水相转移到新管中。最后，按照制造商的说明提取RNA。使用Smart Spec Plus分光光度计(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)定量总RNA。A260/A280比率用于评估RNA纯度。 RT和qPCR试剂盒(Takara，大连)，TLR2的引物序列为：5’-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3’(正向)和5’-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3’(反向)；NF-кB的引物序列为：5’-CTTAGTCTTTGTCTGGTACG-3’(正向)，5’-CCTTTGAAAGTCGTTCGACCCTGAGT-3’(反向)。实时PCR一式三份进行，并计算TLR2、NF-кB的相对表达使用比较循环阈值(CT)(2-ΔΔCT)方法，以甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内源对照来标准化数据，引物序列为：5’-GTACTCT

GTTTGACGTCGACT-3’(正向)和5’-CCTCGATTATAGACTATCTGA-3’(反向)。并使用公式2-ΔΔCT计算TLR2、NF-кB的相对表达量。其中ΔCT=(CT TLR2/NF-кB-CT GAPDH)。

1.6 ELISA测定大鼠膝关节滑膜组织中TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平 酶联免疫吸附法检测膝关节滑膜组织中TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平，具体操作见试剂盒说明书。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对大鼠PWT、PWTL、关节炎症积分的影响 模型组PWT、PWTL评分低于对照组，关节炎症积分高于对照组(P<0.05)；黄芪甲苷各剂量组PWT、PWTL评分高于模型组，关节炎症积分低于模型组(P<0.05)，且随着黄芪甲苷给药剂量的增加，PWT、PWTL评分逐渐升高，关节炎症积分逐渐降低(P<0.05)；黄芪甲苷低、中剂量组PWT、PWTL评分低于秋水仙碱组，关节炎症积分高于秋水仙碱组(P<0.05)；高剂量组PWT、PWTL评分、关节炎症积分与秋水仙碱组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 黄芪甲苷对大鼠PWT、PWTL、关节炎症积分的影响

2.2 黄芪甲苷对6组大鼠踝关节滑膜结构的影响 对照组踝关节滑膜组织结构正常(约1～3层)，无炎性细胞浸润；模型组滑膜增厚，滑膜细胞排列紊乱，大量中性粒细胞浸润；秋水仙碱组及黄芪甲苷组高剂量组关节滑膜结构较为完整，炎性反应较模型组轻，伴少量坏死滑膜细胞坏死，中性粒细胞为少量、分散浸润；黄芪甲苷组中、低剂量组较模型组而言，踝关节坏死滑膜细胞减少，炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 黄芪甲苷对6组大鼠踝关节滑膜结构的影响(HE染色×400)；A 对照组；B 模型组；C 秋水仙碱组；D 黄芪甲苷低剂量组；E 黄芪甲苷中剂量组；F 黄芪甲苷高剂量组

2.3 6组大鼠踝关节滑膜TLR2、NF-кB mRNA表达水平比较 模型组关节TLR2、NF-кB mRNA表达水平高于对照组(P<0.05)；黄芪甲苷各剂量组TLR2、NF-кB mRNA表达水平低于模型组(P<0.05)，且随着黄芪甲苷给药剂量的增加，TLR2、NF-кB mRNA表达水平逐渐降(P<0.05)；黄芪甲苷低、中剂量组TLR2、NF-кB mRNA表达水平高于秋水仙碱组(P<0.05)；高剂量组TLR2、NF-кB mRNA表达水平与秋水仙碱组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 6组大鼠踝关节滑膜TLR2、NF-кB mRNA表达水平比较

2.4 6组大鼠踝关节滑膜TLR2、NF-кB 蛋白表达水平比较 模型组关节TLR2、NF-кB 蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)；黄芪甲苷各剂量组TLR2、NF-кB 蛋白表达水平低于模型组(P<0.05)，且随着黄芪甲苷给药剂量的增加，TLR2、NF-кB 蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)；黄芪甲苷低、中剂量组TLR2、NF-кB 蛋白表达水平高于秋水仙碱组(P<0.05)；高剂量组TLR2、NF-кB 蛋白表达水平与秋水仙碱组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 6组大鼠踝关节滑膜TLR2、NF-кB 蛋白表达水平比较

2.5 6组大鼠踝关节滑膜IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平比较 模型组关节IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)；黄芪甲苷各剂量组IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表达水平低于模型组(P<0.05)，且随着黄芪甲苷给药剂量的增加，IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)；黄芪甲苷低、中剂量组IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平高于秋水仙碱组(P<0.05)；高剂量组IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平与秋水仙碱组差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 6组大鼠踝关节滑膜IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表达水平比较

3 讨论

痛风是一种医学病症，通常以急性炎症性关节炎的反复发作为特征，临床上表现关节，特别是大脚趾关节触痛、灼热、肿胀。痛风性关节炎的明确诊断是基于滑液或痛风中尿酸晶体的鉴定。尿酸晶体是最有效的促炎刺激物，对高尿酸尿晶体的先天性免疫反应与痛风性关节炎的病理学密切相关[12,13]。尿酸微晶体对炎症细胞活化是急性痛风性关节炎的核心特征，促炎性微晶可以与所有主要的滑膜细胞类型相互作用，包括中性粒细胞，单核细胞/巨噬细胞和成纤维细胞样(B型)滑膜细胞。在单核细胞中，尿酸晶体刺激许多促炎细胞因子的合成，如IL-1，IL-6，IL8和TNF-α。研究已发现，痛风关节炎患者的血清中TNF-α、IL-1β等细胞炎性因子过表达，并与急性和慢性关节炎疾病有关。在与宿主细胞接触后，尿酸晶体诱导一系列膜事件，其触发相关的信号传导途径，吞噬作用和细胞因子产生。进入细胞后，尿酸晶体进一步引发炎症小体激活并诱导TNF-α和IL-1β的产生，诱发全谱炎症。单核细胞/巨噬细胞对尿酸晶体晶体吞噬作用后的TNF-α、IL-1β等在炎性反应的起始和传播中起重要作用。黄芪甲苷能抑制脂质过氧化，发挥抗炎症活性，并表现出抗溃疡作用。

本次研究结果显示，黄芪甲苷各剂量PWT、PWTL评分高于模型组，关节炎症积分低于模型组，这说明黄芪甲苷能明显降低尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎疼痛。结合病理学研究结果，对照组踝关节滑膜组织厚度正常，滑膜细胞分布均匀且排列整齐(约1～3层)，无炎症细胞浸润；模型组滑膜增厚，滑膜细胞排列紊乱，大量中性粒细胞浸润；秋水仙碱组及黄芪甲苷组高剂量组关节滑膜结构较为完整，炎性反应较模型组轻，伴少量坏死滑膜细胞坏死，中性粒细胞为少量、分散浸润；黄芪甲苷组中、低剂量组较模型组而言，踝关节滑膜局部粗糙不平，坏死滑膜细胞减少，炎症细胞浸润减少。这说明，黄芪甲苷能抑制尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎。

TLRs是先天免疫受体，其通过检测病原体及外源性化合物的常见分子结构来保护宿主免受微生物感染或外源性毒物的攻击。在十个人TLR亚家族成员中，识别其与TLR1或TLR6相关的配体；这些配体主要是外源性化合物分子，如脂肽，脂磷壁酸和肽聚糖[14,15]。TLR2在前哨免疫细胞中表达，包括树突状细胞，单核细胞和巨噬细胞。TLR2由一个配体结合胞外域，跨膜结构域和Toll/IL-1受体结构域，启动下游信号级联。然后TLR信号激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，这两者都进一步诱导促炎细胞因子。 NF-κB是一种关键的核转录因子，通常由p50和p65亚基组成。 已经有研究确定NF-κB调节促炎性细胞因子的表达，因此在免疫和炎性反应中具有重要作用[16-18]。本次研究结果显示，模型组关节TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表达水平高于对照组；黄芪甲苷各剂量组TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表达水平低于模型组，且随着黄芪甲苷给药剂量的增加，TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表达水平逐渐降；黄芪甲苷低、中剂量组TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表达水平高于秋水仙碱组；高剂量组TLR2、NF-кB mRNA表达水平与秋水仙碱组无明显差异。而黄芪甲苷后可抑制IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白水平。这说明黄芪甲苷能通过抑制炎症信号通路TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表达水平的表达进而抑制炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的表达。

综上所述，黄芪甲苷能明显抑制尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎，其机制与黄芪甲苷能通过抑制炎症信号通路TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表达水平的表达进而抑制炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的表达有关。