Hrd1在博来霉素诱导大鼠肺纤维化中的表达

姚宇 王文军 梁玉灵

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性的、进展的以进行性呼吸困难为主要临床表现的纤维性间质性肺疾病[1]。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(Hmg-CoA reductase degradation protein 1,Hrd1),又名synoviolin，是一种E3泛素连接酶，它广泛的参与内质网相关蛋白降解途径，具有抑制Nrf2的表达、促进Ⅰ型胶原成熟与分泌的作用[2-4]。Ⅰ型胶原是肺组织发生纤维化的主要胶原纤维之一，构成了细胞外基质[5]。Nrf2则是机体抗氧化反应的重要分子，其含量的降低而引起整个氧化/抗氧化反应的失衡是肺纤维化的发病机制之一[6]。因此Hrd1可能在肺纤维化炎症期及纤维化期同时起作用并成为潜在的治疗靶点。本实验利用LS-102干预大鼠肺纤维化模型，检测Hrd1的表达及其与Ⅰ型胶原、Nrf2的关系以初步探究其在肺纤维化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD雄性大鼠60只，6～8周龄，体重(230±40)g，由西南医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(川)2018-17。本动物实验通过西南医科大学动物实验伦理审查(受理号20181221002)。注射用盐酸博来霉素(浙江海正药业股份有限公司，批号17001711)。兔抗大鼠Hrd1、Nrf2多克隆抗体(ProteinTech中国分公司),兔抗大鼠Ⅰ型胶原、TGF-β1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，LS-102(美国Merckmillipore公司),DMSO溶液(美国Sigma公司)，HE、Masson染色试剂(珠海贝索生物技术有限公司)。病理图文分析系统(Olympus)。

1.2 动物模型的制备、处理及分组 将60只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、溶剂组、LS-102组，每组15只。用2%戊巴比妥钠麻醉后，除对照组外缓慢注射博来霉素溶液(5 mg/kg)制备肺纤维化模型，对照组气管内注射等体积0.9%氯化钠溶液，LS-102组根据预实验结果，于造模后予以腹腔注射LS-102溶液(1 mg/kg)，溶剂组、对照组和模型组同时予以腹腔注射等体积DMSO溶液、0.9%氯化钠溶液。各组于实验后每日腹腔注射等体积上述药物至大鼠被处死。分别于造模后第7天、第14天、第28天每组随机各处死5只大鼠。

1.3 肺系数的计算 4组大鼠处死前称重，取肺组织后钝性分离周围组织及血凝块后，予以0.9%氯化钠溶液冲洗至组织变白，用纱布轻柔地吸干水分，称肺湿重，以公式计算肺系数：肺湿重(g)/动物重量(g)×100。

1.4 肺组织病理学变化 4组大鼠肺组织于10%中性甲醛固定24 h后，予以石蜡包埋切片并行HE染色、Masson染色。运用ImagePro-Plus 6.0图像分析系统，HE染色选取炎性最明显的5个中倍镜视野(×200)计算炎性细胞的数量(尽量避开大血管、大气管)。Masson染色显示胶原纤维为蓝色，细胞核为蓝墨色，肌纤维、红细胞为红色，测定阳性区域的累积光密度(IOD)。计算每组炎性细胞数量的平均值及胶原纤维累积光密度(IOD)的平均值。

1.5 免疫组化检测 采用ELPS法检测各组大鼠肺组织Hrd1、Ⅰ型胶原、Nrf2的表达量。取大鼠肺组织固定后进行石蜡包埋并切片。按试剂盒说明书操作，主要步骤为脱蜡、水化，灭活内源过氧化物酶、漂洗、抗原修复，加一抗(1∶100)4℃过夜、冲洗后加入二抗，苏木素复染后脱水、干燥封片。以细胞质或细胞核出现棕黄色染色为阳性反应，颜色越深则表达越强。每个切片取随机取5个高倍镜阳性表达视野(×400)，利用ImagePro-Plus 6.0图像分析系统测定各目标蛋白阳性细胞的累积吸光度值(IOD值)及相应面积(Area)，计算平均吸光度值(MOD=IOD/Area)分别作为Hrd1、Ⅰ型胶原、Nrf2表达量。

2 结果

2.1 大鼠肺系数 模型组大鼠在第7、14、28天肺系数均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。其中LS-102组在第14、28天肺系数均低于模型组，差异均有统计学意义(P0.05)。见表1。

表1 4组大鼠各时间点肺系数变化

2.2 4组肺组织病理学变化

2.2.1 肺组织肉眼观察:第7、14、28天对照组处死大鼠肺组织呈粉红色、组织弹性良好、表面光滑。第7天其余3组多于肺上叶可见大量暗红色片状出血，肺组织肿胀明显、重量增加。第14天，模型、溶剂组、LS-102组大鼠肺组织仍有少许片状出血灶，上叶肺组织出现皱缩，可见少量结节。第28天，模型、溶剂组肺组织颜色稍苍白、质地较硬，上叶肺组织皱缩明显，表面凹凸不平，下叶可见轻度肺组织皱缩、少量结节。

2.2.2 光镜下:光镜观察下，对照组大鼠各时间点肺泡结构完整，均未见明显炎性及纤维化表现，偶见大鼠肺泡周围可见少许炎性细胞浸润。模型组与溶剂组肺泡结构破坏，肺间质周围可见大量炎性细胞浸润，随时间逐渐消退，均仍高于对照组。LS-102组大鼠肺组织仅第7天炎性细胞浸润少于上述2组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与溶剂组肺组织在第14天出现较多胶原纤维沉积，逐渐增高，均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。LS-102组第14天、28天胶原纤维沉积少于上述2组(P<0.05)。见图1、2，表2、3。

图1 4组大鼠肺组织HE染色动态变化(Masson×200)

图2 4组大鼠肺组织Masson染色动态变化(Masson×200)

表2 4组大鼠肺组织炎性细胞数量比较

表3 4组大鼠肺组织胶原纤维IOD比较

2.3 大鼠肺组织免疫组化

2.3.1 肺组织中Hrd1的表达:与模型组及溶剂组相比，所有时间点LS-102组中Hrd1表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组第7天Hrd1表达达到峰值，以后逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图3。

表4 4组大鼠肺组织Hrd1 MOD比较

图3 4组大鼠肺组织Hrd1免疫组化动态变化(IHC×400)

2.3.2 肺组织中Nrf2的表达:与模型组及溶剂组比较，第7天LS-102组中Nrf2表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组第7天Nrf2表达达到峰值，以后逐渐降低。见图4，表5。

图4 4组大鼠肺组织Nrf2免疫组化动态变化(IHC×400)

表5 4组大鼠肺组织Nrf2 MOD比较

2.3.3 肺组织中Ⅰ型胶原的表达:与模型组及溶剂组比较，第14天、28天LS-102组中Ⅰ型胶原表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组Ⅰ型胶原的表达在第14天明显增加，在第28天达到高峰。见图5，表6。

图5 4组大鼠肺组织Ⅰ型胶原免疫组化动态变化(IHC×400)

表6 4组大鼠肺组织Ⅰ型胶原 MOD比较

3 讨论

特发性肺纤维化是慢性进展性致纤维化性的间质性肺炎的一种特殊类型，其准确的发病机制仍然不清楚[1]，预后极差。其整个发病过程可以大致分为炎症期和纤维化期。通过抑制介导两个时期的分子信号通路有望获得有效的治疗方法。Hrd1,是一种E3泛素连接酶，主要参与内质网应激相关蛋白降解。现有研究发现它可作为IRE1-XPB1信号通路的下游效应物参与未折叠蛋白反应而调控Nrf2、参与胶原的合成与成熟，参与了肝纤维化/肝硬化、肾纤维化的发病[2,3]。另有研究表明Hrd1通过调节Ⅰ型胶原的表达和成熟参与了外显显子-4缺陷的肺表面蛋白C所致的间质性肺炎(家族性间质性肺炎)的发病[4]。Nrf2是肺纤维化中早期炎症期的重要保护因子[5]，Ⅰ型胶原是纤维化期的主要组分之一[6]。LS-102是Yagishita等[7,8]研究发现的Hrd1的高选择性抑制剂。本研究在现有报道的基础下，利用LS-102进一步探讨Hrd1在博来霉素所致大鼠肺纤维化的作用。

本研究表明大鼠肺组织Hrd1的表达，在早期肺泡炎症阶段最高，以后逐渐下降，可能Hrd1主要参与大鼠肺纤维化炎症阶段有关。抑制Hrd1后，Nrf2表达增加，在肺泡炎阶段(第7天)最明显。与Wu等[3]研究结果相似。推测主要是因为Hrd1可能主要抑制早期炎症阶段的Nrf2表达，而后期Nrf2升高不明显，可能肺纤维化过程中同时通过调节Nrf2-Keap1等其他炎性反应、氧化应激反应通路抑制了Nrf2的生成。

既往研究发现Hrd1能参与内质网应激引起的未折叠蛋白反应，有降解未折叠蛋白的作用，进而起到细胞保护作用，并且Hrd1是未折叠蛋白反应的三条主要通路之一的IRE1-XBP1的下游效应物[9]。有研究证实内质网应激及其引起的未折叠蛋白反应是广泛参与了肺纤维化的发病过程[10]。结合本实验研究结果，可能为内质网应激参与肺纤维化的具体机制进行了一定的补充。氧化应激反应被证实参与肺纤维化的炎症期发病过程[11]，而Nrf2相关通路是机体抗氧化通路中核心通路的，能对多种抗氧化因子产生促进作用[12]，而本研究结果提示Hrd1可能通过早期抑制Nrf2介导的抗氧化通路而参与肺纤维化的发病。

本研究中，抑制Hrd1后，Ⅰ型胶原在第14、28天表达量明显减少，提示Hrd1可能抑制促进Ⅰ型胶原的表达，与Li等[2]研究结果相近。可能与直接促进其分

泌及成熟有关[4]，但具体机制仍需进一步探讨。多项研究证实以Ⅰ型胶原等为主的细胞外基质的沉积是在肺纤维化进程中起主要作用[6]，本实验结果显示Hrd1可能有促进Ⅰ型胶原表达而参与IPF发病过程。

我们的研究表明，博来霉素致肺纤维化大鼠肺组织中Hrd1大量表达，抑制Hrd1能减少Ⅰ型胶原的表达，增加Nrf2的早期表达。表明Hrd1可能通过促进Ⅰ型胶原表达及抑制Nrf2的生成参与肺纤维化的发生发展，通过抑制Hrd1能减少纤维化期Ⅰ型胶原的沉积和增加炎症期Nrf2的表达以激活体内抗氧化通路，可能为抗肺纤维化药物的研制提供新的靶点。