VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血压患者血清及胎盘中的表达水平研究

朱萍 沈萍

妊娠高血压属于一种常见的妊娠期并发症，主要在妊娠20周后出现，严重威胁母婴健康，会造成孕妇和胎儿死亡[1]。产妇的主要临床表现为高血压、水肿，严重的患者会引发昏迷、抽搐等，会提高母婴死亡率[2]。目前临床中关于妊娠高血压发病相关机制并不明确，妊娠高血压做到及早诊断和治疗，对患者来说至关重要。有研究指出妊娠高血压会导致血管内皮细胞损伤，从而造成多种器官和系统受到损害，主要是增加血管通透性[3]。VEGF具有促进血管发生以及维持血管内皮细胞功能的作用，在研究妊娠高血压严重程度中具有重要意义[4]。ESM-1属于一种新型的与内皮功能紊乱有关的标志物，在研究心血管疾病中关注越来越广泛[5]。ACE作为一种血管紧张素转换酶，对血管紧张素Ⅱ合成有促进作用，同时起到扩张血管降压，对平滑肌细胞生长起到抑制作用[6]。Vaspin是一种脂肪因子，主要是由胎盘分泌。本文旨在研究VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血压患者血清及胎盘中的表达水平，对研究妊娠高血压的发病机制具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年8月至2018年8月在我院就诊的妊娠高血压患者30例为妊娠高血压组，年龄25～35岁，平均年龄(28.6±2.4)岁；孕周34～40周，平均孕周(36.9±4.5)周。患者均符合第7版《妇产科学》的诊断标准，轻度妊娠高血压8例，中度妊娠高血压10例，重度妊娠高血压12例。选取30例在我院体检的正常妊娠产妇为正常组，年龄22～33岁，平均年龄(27.8±3.6)岁；孕周34～41周，平均孕周(37.2±4.3)周。妊娠高血压组和正常组患者年龄、孕周等一般资料比较中差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：所有研究对象符合妊娠期高血压的诊断标准。

1.2.2 排除标准：原发性高血压患者；糖尿病、心脏病患者；合并肿瘤、感染、自身免疫系统疾病患者。本文研究患者及其家属均知情，签署知情通知书。

1.3 方法

1.3.1 标本采集:采集分娩产妇的胎盘组织，产妇分娩后，剪取适量的胎盘组织，用0.9%氯化钠溶液将残留的血液清洗干净，后用滤纸将组织上的水分吸干，在冻存管中保存。抽取研究对象分娩前清晨空腹静脉血3 ml，放置在干净的EP管中，经过冷凝处理后，用离心机以2 500 r/min的速度分离，取上层血清保存至-70℃的冰箱中，冷藏待测。

1.3.2 免疫组化染色处理:将石蜡切片样本放在二甲苯中脱蜡处理10 min，将二甲苯更换后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修复液，在37℃的恒温冰箱中孵化30 min，弃抗原修复液；切片移入湿盒中加入浓度为3%的H2O2，去过氧化物酶封闭液，恒温冰箱孵育10 min，采用PBS淋液冲洗；加入适量的山羊血清，在室温环境下封闭30 min；用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，然后再加入二抗，室温孵育1 h，采用PBS淋液冲洗；经过DAB显色处理10 min，能够在显微镜下观察到棕黄色阳性反应，则采用PBS淋液冲洗1 min；使用苏木精复染3 min，然后用浓度为1%的盐酸乙醇分化处理，自来水冲洗1 min后，脱水并封片处理。

1.3.3 酶联免疫吸附试验检测VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表达:将采集到的标本，取包被液(pH值9.5 0.05 mol/L CB)适当稀释的抗VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin 0.1 ml，添加至聚苯乙烯反应板孔中，加盖后温度4℃ 24 h，次日使用洗涤剂洗涤3次后，甩干。在各孔中加入稀释液(pH值7.4的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释的待测标本0.1 ml，同时加入阳性和阴性的对照标本，在43℃置60 min，将液体移除洗涤3次后，甩干。在各孔中加入VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin的酶标抗体0.1 ml，43℃置60 min。液体移去后洗涤3次，甩干。在各个空中加入底物液(0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml,0.05 mol/L枸橼酸(10.5 g/L)4.86 ml混匀,加入邻苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中,临用时加30% H2O24.0 μl,混匀)0.1 ml，置黑20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，终止反应。在酶标仪上读取A405吸收值。分析VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin水平。

1.3.4 阳性表达结果判定:每个样本在镜头下随机选择5个视野，VEGF蛋白阳性细胞数<20%显示为阴性，SASH1蛋白阳性细胞数≥20%显示为阳性。ESM-1、ACE、Vaspin在血管内皮细胞胞浆以及细胞核中显示棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数<5%为阴性，阳性细胞数≥5%为阳性。所有病理切片均由2位以上经验丰富的医师进行确诊。

2 结果

2.1 2组血清VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表达水平比较 妊娠高血压组血清中VEGF、ESM-1、ACE和Vaspin表达水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组血清中VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin水平比较

2.2 2组胎盘组织中VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin阳性表达率比较 妊娠高血压组胎盘组织中VEGF、ESM-1、ACE和Vaspin阳性表达率高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

表2 2组胎盘组织中VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin阳性表达率比较 n=30,例(%)

图1 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血压和正常孕妇胎盘中的阳性表达(免疫组化染色×200)；A正常孕妇VEGF表达；B妊娠高血压VEGF表达；C正常孕妇ESM-1表达；D妊娠高血压ESM-1表达；E正常孕妇ACE表达；F正常孕妇ACE表达；G正常孕妇Vaspin表达；H正常孕妇Vaspin表达

2.3 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin阳性表达与妊娠高血压严重程度的关系 重度妊娠高血压患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin阳性表达率高于轻度妊娠高血压患者和中度妊娠高血压患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同严重程度患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin阳性表达率比较 例(%)

2.4 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin阳性表达与患者高血压家族史的关系 有高血压家族史患者VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin阳性表达率高于无高血压家族史患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 有无高血压家族史患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin阳性表达率比较 例(%)

2.5 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin之间相关性比较 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin间进行相关性分析，VEGF与ESM-1间呈正相关(r=0.373,P=0.043)；VEGF与ACE间呈正相关(r=0.369,P=0.044)；VEGF与Vaspin之间呈正相关(r=0.479,P=0.007)；ESM-1与ACE间呈正相关(r=0.409,P=0.025)；ESM-1与Vaspin间呈正相关(r=0.481,P=0.004)；ACE与Vaspin间呈正相关(r=0.448,P=0.013)。见图2。

图2 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin间相关性分析

3 讨论

妊娠高血压综合征发病主要受胎盘缺血，血管内皮损伤的影响，血管内皮细胞损伤是引起妊娠高血压的主要原因[7]。有研究指出，全身血管痉挛以及血管内皮损伤会导致妊娠高血压患者的病理生理发生改变[8]。

本研究结果显示，妊娠高血压患者血清中VEGF水平和胎盘组织中VEGF表达高于正常组，本文研究结果与Kemse等[9]研究保持一致。相关研究指出，在妊娠高血压综合征患者血浆中VEGF水平较高，会对血管内皮正常生长发育产生影响，增加缩血管因子产生，减少舒血管因子数量，患者会出现不同程度的蛋白尿、高血压等症状，并且发生病理改变[10,11]。高血压内皮功能紊乱主要有内皮损伤和氧化应激的参与，血管内皮可以产生较多的生物活性物质，在调节血管功能以及结构形成过程中发挥着重要中作用[12]。ESM-1是一种新型的内皮功能紊乱标志物，参与细胞粘附、迁移和增殖过程[13]。本研究结果显示，妊娠高血压患者血清中ESM-1水平高于正常组。说明ESM-1可能参与妊娠高血压的发展。与Hentschke等[14]研究结果保持一致。

妊娠高血压疾病发生的可能作用机制与胎盘滋养层细胞的缺血缺氧有关，内皮细胞损伤会导致机体中NO、PG因子水平降低，同时内皮素、血栓素A2水平升高[15]。项舟弘等[16]研究指出肾素-血管紧张素系统在妊娠高血压疾病中具有重要意义。本研究结果显示，妊娠高血压组血清中ACE水平以及胎盘组织中ACE表达均高于正常组。说明ACE参与妊娠高血压发病。有实验得出，Vaspin在人的胎盘组织有表达，并且咋早期妊娠中Vaspin主要在胎盘细胞滋养细胞以及合体滋养细胞表现，到妊娠晚期，Vaspin只在合体滋养细胞中表达，在早期表达水平较低，在晚期妊娠中显示高峰[17]。霍琰等[18]也在研究中指出，Vaspin基因及其蛋白在妊娠糖尿病患者胎盘组织中显示高表达，本研究结果与其保持一致。

本研究结果显示，VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表达与妊娠高血压患者严重程度有关，并且重度妊娠高血压患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表达表达较高。贾春文等[19]在研究中指出，妊娠高血压疾病患者胎盘组织中ACE基因表达较高，并且重度妊娠高血压患者ACE基因表达高于轻度和中度患者。本研究结果显示，有高血压家族史患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表达相对较高。说明VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表达与妊娠高血压患者有无高血压家族史有关。本文通过VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin之间的相关性研究得出，VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin之间呈正相关，说明VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin参与妊娠高血压发病过程，随病情发展，VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin表达逐渐升高。

综上所述，VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血压患者血清及胎盘中显示高表达，与妊娠高血压的严重程度和有无高血压家族史有关，四项因子之间呈正相关，在妊娠高血压发展中具有重要意义。