固态法小米醋酿造工艺的研究

潘洁琼，张 宇，满都拉，孙子羽，陈忠军

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018）

小米（Setaria italica）是由粟（北方称其为谷子）脱壳而制成的粮食，广泛分布于全世界，中国、印度、尼日利亚、尼泊尔、马里等发展中国家种植较多[1]。小米的营养非常丰富，含有碳水化合物、氨基酸、蛋白质、脂肪、维生素、脂肪酸和矿物质等营养物质，且各种营养成分比例适中，是很好的食品营养源[2-3]。

食醋是人们日常生活中不可缺少的重要调味品，不仅具有调味功能，还具有软化血管、降血脂、延缓衰老、清除自由基、消除疲劳、减少肌肉疼痛等多种营养保健功能[4-7]。食醋组成以醋酸为主，乳酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸等多种有机酸为辅，还包含有由菌种发酵后形成的各种酯类，因而使得食醋成为具有酸、香、绵、甜特色的食品，并且根据所用菌种的不同，形成的食醋风格和口味各异[8]。

食醋生产主要有固态发酵和液态发酵两种方式[9]。传统的固态发酵过程中菌株结构比较复杂，包括不同的酵母、醋酸菌以及各种霉菌。固态发酵的原料为酒醪、粮食等，在原料基础上加入一定量的辅料，辅料的加入极大程度上丰富了产物的种类。固态发酵周期较长，会经历几个月甚至一年，因此固态发酵所含有的成分复杂，生产的醋色香味体俱佳，通常色泽红亮，呈琥珀色或红棕色；具有食醋固有醇香和酯香；酸味柔和、回甜醇厚；体态澄清[10-12]。本试验以小米为原料，采用固态发酵法研制小米食醋，旨在提高小米的综合利用价值，为相关企业开发小米醋提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米（山西产）：市售；米糠、麸皮、细糠：市售；万家兴高产生料酒曲：广州市酒神生物科技有限公司；安琪酿酒曲：安琪酵母股份有限公司；活性醋酸菌：济宁玉园生物科技有限公司；酿醋醋酸菌：上海迪发酿造生物制品有限公司；春丰本酿醋酸菌：沂源康源生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津风船化学试剂科技有限公司；甲醛溶液：天津永晟精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

pHS-29A型酸度计：仪器厂；3-18KS型离心机：德国希格玛实验室离心机公司；DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；0-100型精密酒精计：河北省华鸥县仪器仪表厂；电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

操作要点：

（1）蒸米：蒸米目的是糊化小米中的淀粉，使之更容易转化为糖类物质。要保证蒸至熟而不黏、内无生心的状态。蒸米所需水米比例为2∶3，蒸米大约10 min即可。

（2）拌料：待小米冷却至30 ℃，加入原料20%的辅料及酒曲，安琪酿酒曲进行活化（10倍32～35 ℃的温水，活化10 min），混合后搅拌均匀入缸，密封发酵。

（3）酒精发酵：酒精发酵采用低温发酵，放入大缸，室温25 ℃进行酒精发酵，在酒精含量达到8%vol的情况下停止酒精发酵。

（4）醋酸发酵：酒精发酵结束后，添加辅料使料醅水分含量达到50%左右后接种醋酸菌，在27 ℃左右室温下进行醋酸发酵。醋酸发酵期间需每天翻醋醅两次，以起到通氧与降温散热的作用，保证品温不超过40 ℃，醋酸发酵正常进行。

（5）淋醋：以80 ℃的热水按醋醅重1.2倍的质量将醋醅浸泡24 h，用淋醋装置进行淋醋，为提高澄清度需反复多次进行淋醋，待获得比较澄清的醋液淋醋停止。

（6）陈酿：将所得的醋液置于4 ℃的冰箱进行陈酿。

（7）杀菌：将所得醋液于95 ℃，保温10 min以达到杀菌的目的，杀菌冷却后即得成品新醋。

1.3.2 酒精发酵阶段最佳工艺的确定

单因素试验设计：添加1.5%复合酒曲进行糖化发酵，分别调整酒曲复配比（生料酒曲∶酿酒曲=1∶1、1∶2、2∶1、3∶1）、料醅的水分含量（66%、69%、72%、75%）、不同辅料（麸皮、细糠、米糠）、入缸初始温度（25 ℃、27 ℃、29 ℃、31 ℃）进行酒精发酵，直到酒精含量达到8%vol左右，添加辅料至料醅含水量为50%，接种醋酸菌进行醋酸发酵，最终测定成品新醋总酸含量以及进行感官评定，确定小米醋酒精发酵阶段各单因素对小米醋质量的影响。

依据单因素试验结果，选取主要影响因素进行正交试验，确定小米醋酒精发酵阶段最佳工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 固态法小米醋酒精发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcohol fermentation conditions optimization of millet vinegar by solid-state fermentation

1.3.3 醋酸发酵阶段最佳工艺的确定

单因素试验设计：在酒精发酵完成后的酒醅中添加辅料至料醅含水量为50%，接种醋酸菌进行醋酸发酵，最终测定成品新醋总酸含量并进行感官评定，研究初始酒精度（4%vol、6%vol、8%vol、10%vol）、不同醋酸菌（活性醋酸菌、酿醋醋酸菌、春丰本酿醋酸菌）、醋酸菌接种量（0.13%、0.15%、0.17%、0.19%）、入缸初始温度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）对小米醋总酸含量及感官评定的影响，确定小米醋醋酸发酵阶段的主要影响因素。

依据单因素试验结果，选取影响主要因素进行正交试验设计，确定小米醋醋酸发酵阶段最佳工艺条件。正交试验因素与水平见表2。

表2 固态法小米醋醋酸发酵条件优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic fermentation conditions optimization of millet vinegar by solid-state fermentation

1.3.4 测定方法

还原糖：3,5-二硝基水杨酸法[13]；酒精度：按照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》[14]中的酒精计法；总酸（以醋酸计）：NaOH滴定法[15]；氨基酸态氮：甲醛法[16]；可溶性固形物：烘干法[17]；不挥发性酸：酸度计法[17]。

感官质量评定：选取10名有相关经验的人员进行品评打分，将品评分数取平均值为该样品最终的评分结果。小米醋感官评定标准见表3。

表3 小米醋感官评定标准Table 3 Sensory evaluation standards of millet vinegar

续表

2 结果与分析

2.1 酒精发酵工艺的确定

2.1.1 不同辅料对酒精发酵的影响

图1 辅料种类对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of adjunct types on alcohol fermentation

由图1可知，采用麸皮、细糠和米糠3种不同的辅料进行发酵，麸皮制得食醋的总酸含量为5.1g/100 mL，细糠制得食醋的总酸为3.8 g/100 mL，米糠制得食醋的总酸含量最高，为7.1 g/100 mL，米糠为辅料酿出的小米醋感官评分最高，为86分。因此采用米糠作为辅料进行发酵。

2.1.2 料醅的不同水分含量对酒精发酵的影响

由图2可知，当料醅水分含量＜69%时，小米醪的水分含量越高，小米醪中的糖转化成酒精含量也越多，以至于后期的醋酸发酵产生的醋酸也多。因此总酸含量逐渐上升。当水分含量＞69%的时候，由于水分过多，导致发酵能力受限，小米醪中糖无法充分转化成酒精，酒精度值下降，后期产酸能力也随之下降。料醅水分含量为69%时，发酵所得的成品醋总酸为7.2 g/100 mL，且其感官评分最高，为85分。因此选择料醅水分含量69%进行发酵。

2.1.3 不同酒曲接种比例对发酵的影响

图3 酒曲接种比例对酒精发酵的影响Fig.3 Effect of Jiuqu inoculum ratio on alcohol fermentation

由图3可知，两种酒曲的复配比例（生料酒曲∶酿酒曲）为1∶1时，食醋感官评分最低；当复配比例为1∶2时，食醋总酸含量最低；当复配比例为2∶1时，其总酸含量为7.0 g/100 mL，感官评分为83分，均最高；当复配比例为3∶1时，其总酸含量和感官评分都低于2∶1的复配比例，这可能是因为生料酒曲的添加量过高，而酿酒曲的添加量过少，不利于酒精发酵的进行。因此选择生料酒曲∶酿酒曲=2∶1进行发酵。

2.1.4 不同入缸初始温度对发酵的影响

图4 入缸初始温度对酒精发酵的影响Fig.4 Effect of initial entry temperature of cylinder on alcohol fermentation

由图4可知，入缸初始温度25～29 ℃范围内时，随着温度的升高，小米醋中的醋酸含量也越来越高，这是因为在此温度范围内，酵母生长释放热量后温度不会太高，处于酵母的生长温度范围，酵母菌的活力随着温度的升高而越来越强，小米酒中乙醇含量越来越高，导致小米醋中的醋酸含量也越来越高。但当入缸初始温度高于29 ℃时，由于微生物生长迅速产热，温度迅速上升，温度过高抑制甚至破坏了酵母的活性，小米醪中酒精含量减少，所以生成的醋酸也随之减少，在入缸初始温度为29 ℃时，小米醋的感官评分最高，83分。

2.1.5 酒精发酵正交试验结果

依据单因素试验结果，选取料醅水分含量、酒曲接种比例、入缸初始温度进行L9（34）正交试验，试验结果见表3。

表3 固态法小米醋酒精发酵条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for alcohol fermentation conditions optimization of millet vinegar by solid-state fermentation

由表3可知，水分含量的极差最大，其次是酒曲的接种比例，入缸初始温度极差最小，说明水分含量是影响酒精发酵的主要因素，酒曲接种比例是影响酒精发酵的次要因素，而入缸初始温度对其影响最小。依据正交试验结果得出的最佳酒精发酵条件组合为A2B2C2，即料醅水分含量为69%，酒曲接种比例为2∶1，入缸初始温度为29 ℃，在此条件下制得的食醋总酸含量为7.0 g/100 mL，感官评分为84.3分。

2.2 醋酸发酵工艺的确定

2.2.1 不同醋酸菌种类对发酵的影响

采用不同的醋酸菌株进行发酵酿造食醋，测定其总酸并进行感官评分，结果见图5。

图5 醋酸菌种类对醋酸发酵的影响Fig.5 Effect of acetic acid bacteria types on acetic fermentation

由图5可知，酿醋醋酸菌的产酸量均高于其它两种醋酸菌，为7.0 g/100 mL，说明酿醋醋酸菌活性强于活性醋酸菌和春风本酿醋酸菌，且酿醋醋酸菌的感官评分也都高于其它两种醋酸菌的感官评分，为81分，所以选择酿醋醋酸菌进行小米醋醋酸发酵。

2.2.2 不同初始酒精度对发酵的影响

图6 初始酒精度对醋酸发酵的影响Fig.6 Effect of initial alcohol content on acetic fermentation

醋酸菌对酒精耐受能力有限，酒精浓度超过10%（V/V）会逐渐抑制醋酸菌的生长，钝化其氧化酒精能力，而且在较高酒精含量条件下，乙醛脱氢酶没有乙醇脱氢酶稳定，会造成乙醛的积累，不利于醋酸发酵的进行，因此选择初始酒精度4%vol～10%vol[18-20]进行醋酸发酵，结果见图6。由图6可知，初始酒精度为4%vol时，起始发酵速度快，但最终酸度低，影响产品质量。初始酒精度在5%vol～8%vol时，发酵比较平稳且最终酒精度随着初始酒精度的增加而增加，在初始酒精度8%vol时，总酸含量含量和感官评分均最高，分别为7.0 g/100 mL和83分。初始酒精度在9%vol～10%vol时，由于初始酒精度过高，抑制了醋酸菌的生长，导致了产酸量降低。

2.2.3 不同醋酸菌接种量对发酵的影响

图7 醋酸菌接种量对醋酸发酵的影响Fig.7 Effect of acetic acid bacteria inoculum on acetic fermentation

由图7可知，醋酸菌添加量低于0.15%时，随着醋酸菌添加量的增加，小米酒中越来越多的酒精转化成醋酸，小米酒逐渐转化为小米醋，因此总酸含量随着醋酸菌添加量越来越多。但是，小米酒中酒精含量有限，当醋酸菌接种量高于0.15%时，虽然其总酸含量稍高，但感官评分却较低，口感稍差。所以，当醋酸菌接种量为0.15%时，总酸含量与感官评分均最高，为7.0 g/100 mL和86分。

2.2.4 不同入缸初始温度对发酵的影响

图8 入缸初始温度对醋酸发酵的影响Fig.8 Effect of initial entry temperature of cylinder on acetic fermentation

由图8可知，入缸初始温度低于30 ℃时，小米醋中的总酸含量随着入缸初始温度的升高而越来越多。当初始温度高于30 ℃时，由于初始温度过高破坏了醋酸菌的活性，从而抑制甚至破坏乙醇转化为乙酸，小米醋中总酸含量减少。所以，30 ℃为最优的入缸初始温度，此时的总酸含量为7.0 g/100 mL，感官评分为80分。

2.2.5 醋酸发酵正交试验结果

依据单因素试验结果，选取初始酒精度、醋酸菌接种量、入缸初始温度进行L9（34）正交试验，试验结果见表4。

表4 固态法小米醋醋酸发酵条件优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic fermentation conditions optimization of millet vinegar by solid-state fermentation

由表4可知，初始酒精度是影响醋酸发酵的主要因素，醋酸菌的接种量是影响醋酸发酵的次要因素，而入缸初始发酵温度对其影响最小。依据正交试验结果得出的最佳醋酸发酵条件组合为A2B2C3，即初始酒精度为8%vol，醋酸菌接种量为0.15%，入缸初始温度为31 ℃，在此条件下制得的食醋总酸含量7.1 g/100 mL，感官评分为87.6分。

2.3 理化指标检测结果

由表5可知，小米醋的理化指标检验结果均符合GB/T 18187—2000《酿造食醋》的要求。

表5 小米醋理化指标的检验结果Table 5 Results of physical and chemical test of millet vinegar

3 结论

通过对小米醋的固态酿造工艺路线进行探索，采用对酒精发酵和醋酸发酵两阶段单因素及正交试验确定了最佳的原料配比及生产条件。即采用米糠作为辅料，在酒精发酵阶段料醅水分含量为69%，酒曲接种比例为2∶1，入缸初始温度为29 ℃，酒精度为8.0%vol时接种酿醋醋酸菌，接种量为0.15%，入缸初始温度为31 ℃。在此最佳条件下酿造的小米醋理化指标符合国家标准要求，总酸含量为7.1 g/100 mL，小米香突出，酸味柔和，风味典型。