纯种强化发酵细菌型水豆豉细菌菌群动态研究

郭 娅，黄晓润，黎忠杰，曾金兴，陶 怡，吴拥军

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025）

豆豉是以黄豆、黑豆为主要原料，利用微生物发酵制成的调味副食品，是深受我国民众欢迎的传统发酵食品[1]。其中，水豆豉是以大豆为原料，煮熟堆积保温发酵后添加佐料（辣椒、姜）而制成的市售产品。贵州水豆豉作为贵州地区特色微生物发酵大豆食品，其主要为细菌型豆豉。研究发现，豆豉中含有多种生理活性物质，具有特殊的保健作用，能促进皮肤、小肠粘膜损伤修复，保证机体生物氧化正常进行，并含有18种氨基酸，其中7种为人体必需氨基酸[2-4]。此外，还具有和胃、除烦、祛寒的功效，对减少血中胆固醇、降低血压也有一定作用。

迄今为止，对豆豉安全性方面的研究很少。在已有报道中，黄欣[5]从浏阳豆豉中分离出危害肾脏的赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和可致动物肝癌、胃癌的聚多曲霉（Aspergillus sydowi）；廖万清等[6]研究发现，聚多曲霉可引起阻塞性支气管曲霉病；蒋立文等[7]研究发现，曾有因食用细菌型豆豉引起的A型肉毒毒素中毒事件；WEI C L等[8]研究发现，组胺、高浓度NaCl、黄曲霉毒素也对豆豉食用性产生影响，所以豆豉内微生物种类对食用安全存在极大影响，是一个值得关注的焦点。

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）技术能分离长度相似但序列组成不同的双链聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物[9-10]，是检测微生物群落遗传多样性的主要分子生物学方法之一。MUYZER G等[11]在1993年首次将DGGE技术应用于微生物群落结构[12-13]的研究，1999年首次应用于食品微生物多样性检测[14-15]。目前，DGGE技术已广泛应用于发酵食品中微生物多样性的研究[16-17]。

本研究采用PCR-DGGE技术首次对贵州枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2纯种强化发酵的细菌型水豆豉工厂化生产过程中前发酵（制曲期间）和后发酵过程中细菌菌群变化进行研究，解析细菌型水豆豉生产过程中食源性致病菌的动态变化，对评估其生物安全性以及指导生产控制具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

豆豉样本：贵阳某水豆豉生产企业。

1.1.2 菌株与载体

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ 3-2、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：本实验室保藏菌种；测序载体pGEM-T Easy Vector System I：美国Promega公司。

1.1.3 试剂

尿素、三羟甲基氨基甲烷、甲叉双丙烯酰胺：美国BIO-RAD公司；过硫酸铵：北京Solarbio公司；乙二胺四乙酸二钠、丙烯酰胺、去离子甲酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：美国AMRESCO公司；冰醋酸：重庆川江化学试剂厂；GelRedTM 1000：美国BIOTIUM公司；氯化钙：德国Sigma公司；琼脂糖：吉恩（上海）贸易有限公司；甲醛：重庆川东化工（集团）有限公司；无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：上海根生生物科技有限公司；NaCl：苏州同盛医药科技有限公司；琼脂粉：美国Sigma-Aldrich（集团）有限公司；E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit Ⅰ（200）、E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（200）：美国Omega公司；Bacterial Genomic脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Extraction Kit Ver.3.0：日本Takara公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。

1.1.4 培养基

LB固体培养基：胰蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，氯化钠1 g，琼脂粉3 g，去离子水100 mL，调pH值至7.2。LB液体培养基中不添加琼脂粉。

1.2 仪器及设备

DCodeTMUnivesrsal Mutation Detection System、C1000 TouchTMThermal Cycler、Univesrsal Hood Ⅱ凝胶成像分析仪：美国Bio-Rad公司；Eppendorf Centrifuge 5417R离心机：德国Eppendorf公司；Applied Biosystems Veriti 96 Well ThermalCycler聚合酶链式反应仪：上海拜力生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纯种强化发酵细菌型水豆豉工艺[18]

将高温高压（110 ℃、20 min）蒸煮好的黄豆，冷却至40～50 ℃，活化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2菌液使其OD600nm值在0.5～0.8，按4%接种量喷雾接种，搅拌均匀，置于发酵室，37 ℃发酵66 h（前发酵）制曲，按配方添加辅料（生姜、辣椒、食盐），装瓶，放入恒温室，40 ℃发酵7 d（后发酵），即为成品水豆豉。

采用五点定时取样法取200 g纯种强化发酵细菌型水豆豉，混匀，4 ℃密封保存。前发酵为每6 h取样一次，周期3 d；后发酵为每天取样一次，周期7 d，共19个样。

1.3.2 水豆豉宏基因组提取

分别取前发酵和后发酵期间不同时间段的水豆豉样品5 g，置于10 mL无菌磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）中，150 r/min离心30 min，自然沉降5 min，吸取1 mL菌悬液，12 000 r/min离心2 min，弃上清；加1 mL无菌水重悬清洗，12 000 r/min离心2 min，收集菌体。采用Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取水豆豉样品的宏基因组，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 PCR扩增

以水豆豉宏基因组为模板，选用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及1492R（5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'）对细菌的16S rDNA进行PCR扩增。PCR扩增体系：10×PCR Buffer 2 μL、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1.6 μL、27F 0.4 μL、1492R 0.4 μL、模板0.4 μL、rTaq酶0.1 μL、超纯水15.1 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃再延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

以16S rDNA序列为模板，采用引物338F（带GC夹）（5'-CGCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3'）及518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）对细菌的16S rDNA的V3区序列进行降落式PCR扩增。

PCR扩增体系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、338F 1 μL、518R 1 μL、模板1 μL、rTaq酶0.25 μL、超纯水37.25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，68 ℃（每循环降0.5 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，20个循环；72 ℃再延伸7 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4 DGGE电泳及图谱分析

参照MUYZER G等[11]方法，对16S rDNA的V3区序列PCR扩增产物进行DGGE，凝胶成像拍照，用Quantity One分析电泳条带差异。

1.3.5 DGGE切胶回收及克隆测序

切取DGGE明亮的目的条带，加双蒸水（ddH2O），4 ℃过夜保存。取1 μL上清液作为模板，用不带GC夹的V3区引物338F'（5'-TACGGGAGGCAGCAG-3'）及518R'（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）进行PCR扩增，采用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（200）回收纯化，与载体pGEM-T Easy Vector System I连接后，转化至E.coli（DE3）感受态细胞，涂布于含有60 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37 ℃过夜培养。挑取阳性单菌落加入含有60 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃、180 r/min培养12 h，提取质粒，委托大连宝生物公司测序。

1.3.6 数据分析

采用Quantity One 4.6.2软件对DGGE图片处理分析。将优势条带和变化明显的条带切胶回收后测序，测序所得的16S rDNA的V3区序列提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行Blast同源性比对搜索[19]。采用Sensitivity 10、Lane Width 4mm、Min.Density 0.00%、Noise Filter 4.84、Shoulder Sens.1.0处理电泳条带、粗定量分析。

2 结果与分析

2.1 水豆豉样品宏基因组的提取

水豆豉样品宏基因组的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。由图1可知，基因组条带都较为完整、少量降解，基因片段碱基长度在15 000 bp左右，可进行16S rDNA PCR扩增。

图1 细菌型水豆豉前发酵（A）及后发酵（B）样品的宏基因组Fig.1 Metagenome of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

2.2 PCR扩增

以纯种强化发酵细菌型水豆豉前发酵（A）及后发酵（B）样品的宏基因组为模板进行16SrDNAPCR扩增，结果见图2。由图2可知，PCR扩增产物条带单一且碱基长度为1 500 bp左右，与目标结果相符，可用其作为模板进行16S rDNA V3区序列PCR扩增，结果见图3。由图3可知，PCR扩增产物条带单一且碱基长度为250 bp左右，与目标结果相符，可用于DGGE实验。

图2 细菌型水豆豉前发酵（A）及后发酵（B）样品16S rDNA PCR扩增产物Fig.2 PCR products of 16S rDNA of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

图3 细菌型水豆豉前发酵（A）及后发酵（B）样品16S rDNA V3区序列PCR扩增产物Fig.3 PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

2.3 DGGE结果分析

通过quantityone 4.6.2软件处理DGGE结果，结果见图4。对不同发酵时间的DGGE条带数进行统计，结果见图5。选取条带明亮清晰度高的24条条带进行测序、鉴定，鉴定结果见表1。各个发酵时期水豆豉样品中细菌的分布见图6。

图4 细菌型水豆豉样品16S rDNA V3区序列PCR扩增产物的DGGE图谱Fig.4 DGGE map of PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacteria in bacterial water-Douchi samples

图5 细菌型水豆豉样品16S rDNA V3区序列PCR扩增产物的DGGE条带数Fig.5 DGGE band numbers of PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacterial water-Douchi samples

表1 DGGE条带鉴定结果Table 1 Identification results of DGGE band

续表

图6 细菌型水豆豉样品发酵过程中细菌的分布Fig.6 Distribution of bacteria in bacterial water-Douchi samples during fermentation

DGGE图谱中每一泳道条带的数量代表微生物的丰富度，亮度强弱代表细菌的数量。由图4、图5可知，在前发酵42 h后，细菌种类数量丰富并趋于稳定。后发酵第5天细菌种类最多，推测是由于后期加辅料时带入的外源细菌。由表1可知，24条条带中有3条只能鉴定到属，4条为未培养克隆细菌。整个发酵时期共鉴定出6个属共15个种，分别为芽孢杆菌属、沙雷菌属、产碱菌属、肠球菌属、不动杆菌属以及变形杆菌属。由图4及图6可知，枯草芽孢杆菌存在水豆豉的整个发酵期间，且数量最多，为主酵细菌。解淀粉芽孢杆菌一直存在发酵过程中，属于优势菌。前发酵18 h后出现热噬淀粉芽孢杆菌，分析可能由于曲温达到50 ℃左右，适宜嗜热细菌的生长，而其他一些不适宜高温的微生物则被抑制。同时，从中共检测到6种条件致病菌，分别为粘质沙雷菌（Serratia marcescens）、粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）与鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）。其中，粘质沙雷菌与粪产碱杆菌只存在前发酵0～6 h，推测可能是发酵前带入的菌或发酵室环境污染。鲍曼不动杆菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、屎肠球菌在前发酵第66小时以及后发酵阶段被检出，推测可能是由于添加辅料时污染或辅料本身带有。其中，P.mirabilis首次被发现存在于贵州细菌型水豆豉中。检测到的屎肠球菌有较强的产酪胺和苯乙胺的能力[20]，而芽孢杆菌属产尸胺，变形杆菌属产组胺，沙雷氏菌属产腐胺[21]。在豆豉发酵过程中，这4个菌属细菌的存在影响贵州水豆豉生物胺含量。鲍氏不动杆菌是目前临床上较为常见的条件致病菌。有研究发现，大蒜素对鲍氏不动杆菌有抑菌作用[22]。而蜡样芽孢杆菌在10 ℃以下时停止繁殖，在100 ℃条件下处理20 min可被杀死，生长最低水分活度为0.95[23]。因此，豆豉发酵可以通过添加抑菌性辅料（如大蒜素、辣椒、盐等）或控制发酵条件（如温度、湿度、含氧量等）[21-23]抑制甚至杀死原料中本身带有或后期带入的（条件）致病菌，对工业化生产豆豉的污染菌防控具有理论指导意义。

3 结论

通过PCR-DGGE技术研究发现，纯种强化发酵水豆豉前发酵42 h后，细菌种类及数量丰富并趋于稳定，后发酵第5天，细菌种类达到最大。从中共鉴定出6个属15个种，包括芽孢杆菌属（Bacillus）、沙雷菌属（Serratia）、产碱菌属（Alcaligenes）、肠球菌属（Enterococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）以及变形杆菌属（Proteus）。整个发酵期间共检测出6种条件致病菌，分别为粘质沙雷菌（Serratia marcescens）、粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）与鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、屎肠球菌（Enterococcus faecium），其中，奇异变形杆菌首次报道存在于贵州纯种发酵细菌型水豆豉。证实纯种强化发酵水豆豉有条件致病菌污染，具有潜在的食品安全隐患，因此，在水豆豉发酵过程加强注意环境卫生、控制发酵条件可避免条件致病菌的产生。