糖皮质激素受体激活对心肌细胞损伤后影响的实验研究

王吉静 徐金义 姬艳芳 郑帅 杜杰

450003 郑州大学人民医院(河南省人民医院)心肺功能科(王吉静、徐金义)；450003 河南省疾病预防控制中心(姬艳芳)；100029 首都医科大学附属北京安贞医院 北京市心肺血管疾病研究所(郑帅、杜杰)

心肌缺血和心肌炎等是导致心肌损伤的最常见原因，若诊治不及时可发展为心力衰竭。急性心肌损伤常伴发大量炎症细胞的浸润和细胞凋亡和坏死，大量心肌细胞的丧失导致心脏损伤加重和功能失调[1-4]。急性心肌梗死(myocardial infarction，MI)等应激情况可诱导糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)释放增加。糖皮质激素主要是通过和细胞内的糖皮质激素受体(glucocorticoid Receptor，GR)结合，发挥其生理和药理效应，对多种基因具有转录调控作用，有抗炎、抑制细胞凋亡等作用[5-6]。糖皮质激素及其受体并对心肌细胞损伤的影响尚不完全清楚。本实验通过小鼠腹腔注射糖皮质激素(地塞米松)后制作MI模型和体外缺氧刺激心肌细胞系，观察心肌细胞在应激作用下糖皮质激素的激活，分析其激活对心肌细胞炎症因子的表达、对细胞凋亡和坏死的作用及心肌损伤后心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

12周龄雄性C57B/L6J小鼠80只，SPF级，由维通利华生物科技有限公司提供，在北京安贞医院实验动物中心所属的SPF级动物房饲养，按照随机数字表法随机分为生理盐水(盐水)组和地塞米松(地米)组，再分别分为假手术组(sham)和手术组(MI)，即盐水+假手术组(20只)、地米+假手术组(20只)、盐水+MI组(20只)和地米+MI组(20只)。手术组结扎小鼠左冠状动脉前降支制作MI模型，假手术组只绕线不结扎，并于术前24 h分别腹腔注入生理盐水及地米(20 mg/kg)。本研究符合医学动物研究伦理学要求。

1.2 MI模型的复制和超声心动图检测心功能

使用实验室常规方法制作MI模型[7]。MI后第1天和7天，应用Vevo2100超声成像系统(Visual Sonics公司，加拿大)进行超声心动图检查，探头频率30 MHz，测量左室(left ventricular，LV)舒张末期内径(LV end-diastolic diameter，LVEDD)，左室收缩末期内径(LV end-systolic diameter，LVESD)，算出左室射血分数(LV ejection fraction，LVEF)和短轴缩短率(LV fractional shortening，LVFS)。

1.3 心脏病理切片制备和Masson、免疫组织化学染色、TUNEL染色

模型复制后第1、7天取材，石蜡切片脱蜡至水，常规Masson试剂染色和免疫组化染色，用尼康显微镜(尼康公司，日本)采集图像后测量心梗面积和观察磷酸化GR的表达[8]。于MI术后第1天心梗收取心脏，分离左心室，取梗死交界区心肌组织进行冰冻切片，按TUNEL试剂盒(Promega公司，美国)说明书进行染色，DAPI封片，尼康N90i显微镜图像采集图像，NIS分析软件分析凋亡细胞的百分比。

1.4 细胞因子检测试剂盒和实时定量PCR检查脂联素的蛋白和mRNA水平

术后第7天收取心脏，分离左心室，将左心室分为梗死区和非梗死区[8]。取梗死区，研磨法并加入组织裂解液提取总蛋白，使用多因子试剂盒检测心脏组织脂联素细胞因子的表达，软件分析系统计算细胞因子的蛋白浓度；取梗死区，Trizol法抽提总RNA，测定RNA纯度，浓度后反转为cDNA，RT-PCR法检测脂联素因子的mRNA表达(脂联素：正义链5’-CCCAGTCATGCCGAAGATGA-3’，反义链5’-CACAAGTTCCCTTGGGTGGA-3’)。

1.5 体外H9c2心肌细胞培养和蛋白印迹技术、碘化丙啶/Hoechst染色法

H9c2大鼠心肌细胞系于培养皿中提前12 h用地米(0.1 μM、1 μM)，或提前给予GR拮抗剂RU486(1 μM)处理，再替换为缺氧溶液处理并放入缺氧仓(5% CO2、1% O2、94% N2)90 min，恢复正常培养情况，对照组：给予DMEM高糖培养液[9]，处理后的细胞提取总蛋白，采用蛋白印迹技术(western Blot)分析磷酸化GR的表达，一抗为phospho-GR(Cell Signaling Technology公司，美国)，对照蛋白：GAPDH单克隆抗体(中杉金桥，北京)，结果采用Odyssey扫描仪扫描并进行光密度值分析。96孔板处理心肌细胞，经缺氧缓冲液处理后进行原位碘化丙啶和Hoechst 33258(终浓度：1 μg/mL，BD公司，美国)染色，Image Xpress XL高内涵筛选分析仪扫描分析死/活细胞百分比，MetaXpress软件计算凋亡及坏死细胞占全部细胞(hoechst染色)百分比。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 MI模型制作后观察磷酸化GR的表达

通过对梗死后1 d小鼠心脏切片，免疫组化染色(图1A)和Western blot结果(图1B)，发现较盐水+手术组，地米+手术组的心肌细胞磷酸化的GR表达明显增加(P<0.05)。

A：盐水+手术组和地米+手术组心脏切片的磷酸化糖皮质激素受体的免疫组化染色结果(×400，n=5)；B：小鼠心肌梗死后心脏组织磷酸化糖皮质激素受体的western blot结果(n=5)，aP<0.05

2.2 地塞米松预处理改善小鼠心肌梗死后心功能

超声心动图检测MI前及MI后1 d和7 d时的小鼠心功能，发现给予地米+MI组小鼠的左心室功能较盐水+MI组升高，左室LVEF、LVEDD、LVESD、LVFS等心功能指标均明显改善(均为P<0.05)(表1)。

表1 超声心动图检测心肌梗死后心功能

2.3 地米对小鼠MI后心脏损伤的影响

通过对MI后7 d小鼠心脏切片Masson染色发现，地米+MI组小鼠的心脏梗死面积减小(34.8%±5.8% 比 44.1%±3.6%，P<0.05)，提示地米可以减轻梗死后心脏损伤(图2)。

A：四组小鼠的心脏切片的Masson染色结果(×40，n=5)；B：梗死面积结果(n=5)，生理盐水+MI组与地塞米松+MI比较，aP<0.05

2.4 地米升高小鼠MI后心肌的脂联素水平

通过多细胞因子检测试剂盒检测MI后心脏组织中细胞因子的表达，发现给予地米+MI组的脂联素的蛋白水平有明显的升高(2.82倍，P<0.05)，实时定量PCR方法发现地米+MI组的脂联素mRNA水平明显升高(6.45倍，P<0.05)。

2.5 地米减轻心肌细胞凋亡水平

对MI后1 d的心肌组织行TUNEL染色，观察其细胞凋亡情况，结果发现，地米可减轻MI后细胞凋亡(图3)。

A：TUNEL试剂盒染色检测小鼠心梗后1 d心脏组织的细胞凋亡水平，绿色为凋亡细胞，蓝色为细胞核(n=5)；B：凋亡细胞百分比，生理盐水+MI组与地塞米松+MI比较，aP<0.05

2.6 缺氧刺激导致心肌细胞磷酸化GR升高

体外培养H9c2大鼠心肌细胞系，在正常培养基和缺氧缓冲液处理后，western blot检测观察心肌细胞磷酸化GR的表达，发现在缺氧buffer处理12 h后，心肌细胞磷酸化的GR表达增加(1.75倍，P<0.05)。

2.7 地米可减轻心肌细胞坏死

用H9c2大鼠心肌细胞系，发现缺氧刺激可导致心肌细胞的凋亡和坏死明显增加，而地米可抑制缺氧导致的细胞的凋亡和坏死，而用RU486拮抗GR后，地米的抑制凋亡和坏死作用消失(图4)。

a-f：H9c2大鼠心肌细胞系在正常处理、缺氧处理、缺氧刺激前加地塞米松 0.1 μM，地塞米松 1 μM，RU486 1 μM，RU486 1 μM+地塞米松 1 μM，PI/Hoechst染色贴壁细胞，使用高内涵荧光扫描仪检测PI阳性细胞的占全部细胞的个数，gP<0.05，hP<0.01，各组n=6

3 讨论

糖皮质激素以其抗炎及免疫抑制作用广泛应用于临床炎症及免疫相关疾病[5]。生理或病理性应激均可以导致循环系统糖皮质激素的升高，糖皮质激素通过与GR结合，调节机体代谢和生化稳态。研究发现，心肌细胞特异敲除GR(Cardio GRKO)小鼠自发性出现心肌肥厚和左心室收缩功能异常，最终死于心力衰竭，而基因表达显示，心肌细胞缺失GR后，大量与心血管疾病相关的基因发生改变，包括损害钙离子的转移、增加氧化应激、增加细胞死亡等基因表达增加，而抑制心肌肥厚、促进细胞存活等基因表达下调[10]；而以往动物实验及体外实验研究发现，糖皮质激素可以通过下调转录生长因子、肿瘤坏死因子等炎症因子的表达，急性诱导一氧化氮合酶产生，诱导动物心肌细胞环加氧酶2产生，上调心肌细胞脂质运载蛋白前列腺素D的表达等，改善心肌缺血缺氧后心脏功能，保护缺血再灌注后心肌损伤，发挥心脏保护作用[11]。而我们实验发现，给予糖皮质激素后发现心肌细胞GR激活增加(图1)，梗死面积减小(图2)，可能与其升高心肌脂联素水平，减少缺血缺氧刺激所致心肌细胞凋亡及坏死有关(图3、图4)，从而发挥对缺血缺氧后心肌细胞的保护作用，改善心脏功能(表1)。

脂联素有抗炎、抗动脉粥样硬化和改善胰岛素抵抗等多种作用，是预测冠心病和糖尿病的新标志物。大量流行病学证据支持脂联素在心血管中的保护作用：血清脂联素与冠状动脉的狭窄程度呈负相关；急性MI后血液中的低脂联素水平可预示不良心血管事件的发生，MI后血浆中脂联素水平与心肌射血分数的恢复正相关[12-13]。体外实验中，脂联素可促进细胞存活、抑制细胞死亡；源自心肌细胞的脂联素具有生物活性和生理功能，可能通过多种路径发挥其对MI后心肌的保护作用，明显改善MI后心室重构及心脏功能[14]。以往研究发现糖皮质激素可升高血清中脂联素的表达[15]，我们的实验进一步证实，糖皮质激素后可以增加心脏组织中脂联素的蛋白和mRNA水平，继而发挥保护心梗后心功能的作用，说明糖皮质激素对心肌细胞的保护作用与脂联素表达相关。

MI早期，缺血缺氧所致大量心肌细胞的凋亡和坏死，严重影响存活率和心功能。已有实验证明糖皮质激素可减少心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤[16]：动物实验发现糖皮质激素可以通过诱导心肌细胞bcl-xl等抗凋亡基因的表达，减少心梗后心肌细胞凋亡，体外实验发现糖皮质激素可以诱导心肌细胞在应激刺激下抗凋亡基因的表达增加和促凋亡基因的表达下调[17]。我们实验结果发现，GR激活后，可抑制缺氧刺激导致的心肌细胞凋亡和坏死，可能与Bcl-2/Bax基因调控相关。

本研究尚存一定局限性：(1)GR激活对心肌损伤后炎症细胞的浸润和炎症因子的释放，其相关信号通路需要进一步的研究；(2)本实验仅通过复制小鼠MI模型来观察GR对心肌细胞损伤的影响，缺少其他影响心肌细胞功能的模型进一步实验；(3)我们进一步有心肌细胞特异性基因敲除小鼠(MGRKO)实验来验证，心肌细胞特异性缺失GR对MI后心功能、心肌细胞的凋亡、炎症细胞的浸润等均有明显影响，但对心肌细胞的其他作用及长期心功能影响的需进一步的实验验证。总之，糖皮质激素可能通过激活其受体，减少缺血缺氧刺激导致的炎症因子释放、心肌细胞凋亡和坏死，保护心脏损伤后心脏功能。

利益冲突：无