中性鞘磷脂酶2对缺氧预处理间充质干细胞来源的外泌体生物学特性的影响

卢凯 王香云 罗玉寅

313000 湖州市第一人民医院心内科(卢凯、罗玉寅)，神经内科(王香云)

研究发现，干细胞治疗可改善心肌梗死后心功能，可能通过促进梗死周边血管再生、减少心肌细胞死亡来发挥作用[1]。其中，骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其易于获得，免疫排斥较弱，已被广泛用于研究[2]。但干细胞移植后存在凋亡快、归巢率低等弊端，影响其疗效。近年研究发现，干细胞可以分泌外泌体(exosome)，它是一种有膜的纳米囊泡，直径30～100 nm左右。外泌体的分泌及其对受体细胞的生物学作用可能在MSCs的旁分泌中扮演重要角色，其可能成为替代干细胞用于治疗心肌梗死的新型生物制剂。外泌体可以减轻组织损伤、提高组织修复[3-4]，这可能与它的内含物有关。有报道显示，外泌体包含如细胞因子、蛋白、脂质、mRNA、微小RNA(microRNA，miR)等多种细胞成分[5-8]。外泌体中有益成分越多其生物学作用可能越好，但其内容物的分泌方式目前尚未明确。中性鞘磷脂酶2(neutral sphingomyelinase 2，nSMase2)参与外泌体的分泌过程，但缺氧条件下其对外泌体的影响尚未见报道，为此本研究首次探讨缺氧条件下外泌体内容物分泌的机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器与试剂

低温超速离心机(美国，贝克曼)；荧光定量PCR仪(美国，ABI)；DMEM/F12培养基(Corning)；胎牛血清(普飞生物)；Matri-gel(BD)；RNA提取：TRIzol(Life Technology)；GW4869(美国，Sigma-Aldrich)。

1.2 骨髓MSCs的培养和鉴定

取6周龄C57BL/6小鼠下肢长骨骨髓，采用全骨髓培养，传代至第3～4代的小鼠MSCs，采用流式细胞术鉴定细胞表型，包括CD31、CD29、CD34和CD44。

1.3 骨髓MSCs的缺氧预处理

以第3～4代小鼠MSCs作为缺氧预处理对象，分为缺氧预处理组和常氧组，计数相同数量的细胞/培养皿，待细胞充分贴壁12 h后，观察细胞状态，确认细胞状态良好后去除细胞上清，更换为无血清培养基，将缺氧预处理组放置于缺氧培养箱(0.5% O2，5% CO2)48 h，常氧组置于常氧下(21% O2，5% CO2)48 h。抑制nSMase2采用在缺氧预处理组中加入浓度为10 μM GW4869的培养基。

1.4 骨髓MSCs来源的外泌体提取和鉴定

同时收集缺氧预处理组和常氧组培养48 h后条件培养基(细胞上清)，通过超速离心法获得外泌体。具体步骤：细胞上清在4℃下多步骤离心：300 g离心10 min、2 000g离心10 min、12 000 g离心30 min，分别去除死细胞、细胞碎片和细胞微泡；收集上清后再使用100 kD超滤管浓缩细胞上清，4 000 g离心15 min；再次收集上清并在超速离心机上4℃ 100 000 g离心1 h，观察沉淀，轻轻弃去上清，用PBS重悬沉淀；之后继续以相同条件离心1 h；获得的最终沉淀用50～100 μl PBS重悬，冻存于-80℃待用及后续鉴定、实验。通过蛋白质印迹实验(Western Blot)检测外泌体表面标记，如CD63和Alix等。通过电镜观察外泌体的典型形态和粒径大小，并用Zetaszier Nano-S90仪器再次验证外泌体的粒径大小。

1.5 小鼠心肌梗死模型的建立和心功能的测定

参照文献[9]，采用8周龄雄性C57BL/6小鼠，开胸后结扎冠状动脉左前降支，建立心肌梗死模型。实验分为4组：对照组(Sham组)，缺氧预处理来源外泌体组(ExoH组)，常氧来源外泌体组(ExoN组)和PBS组。每组实验小鼠20只，实验按双盲进行，结扎后即刻于周围心肌组织中注射外泌体(约收集自2×107MSCs)，PBS组注射相同剂量的PBS，分3点注射，10 μl/每点。于心肌梗死术后当天(0 d)、3 d、7 d、14 d和28 d，采用二维M型超声心动图对各组小鼠的心功能进行评价。

1.6 组织学分析

实验按双盲进行，收集心肌梗死后28 d各组小鼠的心脏，用甲醛固定、石蜡包埋，用于后续病理切片。梗死面积评估：以结扎线以下500 μm，对后续的组织切片用Masson’s trichrome染色来显示心肌梗死面积，并用Image-pro Plus软件分析每个心脏切面的梗死区域及整个左心室面积，将梗死区域面积除以整个左心室面积即可得出心肌梗死百分比。

1.7 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs)管腔形成实验

在铺有BD matrigel的96孔板上接种相同细胞数的HUVECSs，处理分为3组：ExoH组、ExoN组和DMEM/F12组。每隔1～2 h在相差显微镜下观察管腔形成的情况并拍照记录，最后统计管腔长度。

1.8 H9c2心肌细胞凋亡实验

H9c2凋亡实验(TUNEL实验)在6孔板上进行，将H9c2细胞以1×105/孔接种，根据实验分组处理24 h，根据TUNEL试剂盒染色，在荧光显微镜下观察凋亡细胞数，最后计算凋亡率。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 骨髓MSCs来源的外泌体鉴定

传代至第4代的小鼠MSCs通过流式细胞术鉴定，其结果为CD29、CD44阳性，CD31、CD34阴性。在电镜下观察到的外泌体形态类似杯状结构，直径约100 nm(图1A)；Western Blot检测显示，外泌体表面相关标记物CD63、Alix均阳性(图1B)；此外，通过动态光散射(DLS)分析外泌体的粒径大小，直径亦在100 nm左右，与电镜结果基本相同。

A：电镜下显示外泌体形态类似杯状结构(箭头所示)；B：Western Blot检测结果

2.2 缺氧预处理的骨髓MSCs来源的外泌体可保护小鼠心肌梗死后心功能

在小鼠心肌梗死后7、14和28 d，ExoH组小鼠心功能较ExoN组、PBS组均有明显改善，其中28 d时ExoH组小鼠射血分数显著高于ExoN组(44.12%±8.12%比20.73±7.32%，n=20，t=11.95，P<0.05，图2A)，并且28 d组织学分析表明ExoH能显著减少心肌梗死后瘢痕面积(各组梗死面积百分比：PBS组55.42%±4.32%，ExoN组44.62%±4.21%，ExoH组34.15%±5.32%，n=8，P<0.05，图2B)。

A：心肌梗死后各组小鼠心功能比较(n=20)，与ExoN组比较，aP<0.05，与PBS组比较，bP<0.01；B：心脏组织Masson’s trichrome染色结果显示，ExoH能显著减少心肌梗死后瘢痕面积

2.3 缺氧增加nSMase2的表达可能是由缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)调控的

与常氧下比较，缺氧预处理后，MSCs中的nSMase2的表达明显升高，nSMase2蛋白水平升高约1.5倍，而mRNA水平升高约5.4倍，n=10，P<0.05(图3A)。我们已知Hif-1α可在缺氧状态下被激活并参与重要调控。为进一步研究nSMase2与Hif-1α的关系，我们采用DMOG，一种HIF-1α羟化酶抑制剂，避免Hif-1α在常氧下分解。研究发现，加入DMOG后的MSCs中nSMase2和HIF-1α表达一致性增加，nSMase2和HIF-1α分别升高2.1倍和2.5倍，n=8，P<0.05(图3B)，因此考虑nSMase2可能是由HIF-1α调控的。

A：缺氧增加nSMase2的表达；B：DMOG增加HIF-1α和nSMase2的表达

2.4 nSMase2抑制剂GW4869削弱ExoH的促血管新生能力

为进一步明确nSMase2对ExoH的影响，研究引入了GW4869，一种nSMase2抑制剂，同时提取缺氧预处理下加入GW4869的外泌体(ExoH+GW)。研究发现，与ExoN比较，ExoH具有更好的促血管新生能力，但加入GW4869后其作用明显减弱(图4)。

A：HUVECs管腔形成试验显示，ExoH对管腔形成的作用显著；B：HUVECs管腔形成试验分析显示，aP<0.05，bP<0.05，cP<0.01(n=10)

2.5 nSMase2抑制剂GW4869削弱ExoH的心肌细胞保护能力

为进一步探讨nSMase2对ExoH心肌细胞抗凋亡能力的影响，我们对比了ExoN、ExoH和ExoH+GW在H2O2诱导的心肌细胞凋亡实验中的影响。研究发现，与ExoN比较，ExoH具有更好的心肌细胞抗凋亡作用，但ExoH+GW的抗凋亡作用有所减弱，各组凋亡细胞百分比：Medium组30.21%±10.25%，ExoN组19.56%±6.78%，ExoH组12.34%±4.32%，ExoH+GW组24.56%±9.78%，n=8，P<0.05(图5)。

A：TUNNEL染色结果，黄色箭头所示即凋亡的心肌细胞；B：Cleaved-caspase 3蛋白印迹检测结果，ExoH组的凋亡明显减少

2.6 nSMase2可能参与调控ExoH中有益因子的含量

miR-210是一种缺氧调控的miRNA，由HIF-1α特异性调控[10]，具有促血管新生[11-13]、抗凋亡[12，14]等作用。研究发现，缺氧预处理后miR-210在细胞上清及外泌体的表达均显著上升，分别约为4.8倍和4.5倍，但加入GW4869后明显降低，分别降低至约0.48倍和0.45倍(n=8，P<0.05)。由此推测，nSMase2调控miR-210经外泌体的转运。

3 讨论

本研究发现外泌体能改善心肌梗死后心功能，并且ExoH组心肌梗死后心功能改善明显。同时发现，缺氧预处理的MSCs中nSMase2的表达升高，其可能是由HIF-1α调控的。并且还发现，nSMase2的升高与ExoH的生物学作用存在一定的相关性，综上可能存在HIF-1α-nSMase2-Exo生物学作用改变的调控信号通路。

最近研究发现，nSMase2可能参与外泌体的形成、释放及miRNA、mRNA、蛋白等经外泌体包装及转运的过程[13，15]，但是否对缺氧预处理来源的外泌体有影响未见报道。为进一步探讨nSMase2的作用，我们比较了缺氧调控的miRNA的改变，如miR-210，其是一种缺氧调控的miRNA，在缺氧状态下的细胞或组织中广泛表达[16-17]，具有可以调节细胞周期[18-19]、促血管再生、有利于DNA损伤后修复[20-21]、改善线粒体代谢[22-23]、增强细胞抗凋亡能力等作用。本研究发现，缺氧预处理后MSCs分泌的miR-210在条件上清和外泌体中均显著上升，但加入GW4869抑制nSMase2后，细胞条件上清和外泌体中miR-210的表达水平均显著下降。由此推测，nSMase2对ExoH可能通过影响外泌体内有益miRNA的含量来发挥生物学作用。

综上所述，我们发现缺氧预处理条件下MSCs中miR-210等有益因子表达升高，同时nSMase2的表达亦提升，其可能是由Hif-1α调控的。缺氧预处理骨髓MSCs来源的外泌体拥有更好的心脏保护能力，表现在体内实验中改善心肌梗死后小鼠心功能，体外实验中具有更好的促管腔形成、增加心肌细胞抗凋亡能力等方面。可能的原因是在缺氧预处理条件下，MSCs中miR-210等有益因子的表达增加，同时nSMase2的表达增加有利于miR-210等有益因子经外泌体的包裹及释放来发挥生物学作用。本研究也证实了缺氧预处理是一种有效、安全的方式，可提升干细胞来源的外泌体对心肌梗死动物模型的生物疗效，可为今后用于优化外泌体替代治疗疗效的一种方法，但由于本研究存在一定局限性，样本量少及检测的微小RNA相对单一，因此需要进一步研究。

利益冲突：无