猪ELOVL6 基因多态性与表达差异分析

段梦琪 ，张 健，张芳芳，吴绿草，郭新颖，蔡如玉，祁雨田，商 鹏*，强巴央宗

（1.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000；2.西藏农牧学院藏猪协同研究中心，西藏林芝 860000；3.黑龙江省大庆市杜尔伯特蒙古族自治县一心乡畜牧水产中心，黑龙江大庆 163000）

肌肉生长速度和脂肪沉积能力是猪的重要经济性状[1]。猪的这些经济性状不仅与饲养管理水平有关，更重要的是与调控肌肉生长和脂肪沉积的基因有关[2]。长链脂肪酸延伸酶6(ELOVL6) 基因就是调控脂肪酸合成的重要调控因子之一[3-4]。ELOVL6基因属于超长链脂肪酸延伸酶家族(Elongase of Very Long Chain Fatty Acids，ELOVLs)[5-6]。Takashi 等[7]研究表明，在ELOVL6基因缺失的小鼠中，肝脏内源性脂肪酸的合成被完全抑制，并证实ELOVL6基因通过与脂肪酸的从头合成来维持肝脏内硬脂酸盐和油酸盐含量。因此，ELOVL6基因不仅在脂肪组织中发挥作用，在肝脏组织中也表现出十分关键的作用。

藏猪是我国青藏高原特有的原始小型地方猪种，具有肌内脂肪含量高、肉质鲜美、生产速度慢等特点[8-10]。目前，ELOVL6基因在猪上的研究较少[11]，在藏猪上的研究则几乎空白。随着西藏藏猪产业大力发展，围绕藏猪生长和肉质性状的研究显得越发重要。本实验以藏猪、滇南小耳猪和大约克猪为研究对象，采用RTqPCR 方法检测背脂、背最长肌和肝脏ELOVL6基因mRNA 表达水平的差异，并对ELOVL6基因的Intron 3区域进行了多态性分析，为进一步研究藏猪和滇南小耳猪肌内脂肪沉积与生长发育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验选取藏猪、滇南小耳猪和大约克猪为实验对象，藏猪耳组织样采集于海拔3 000 m 左右的西藏农牧学院教学实习牧场，滇南小耳猪和大约克猪采集于云南省西双版纳。共采集112 头份耳组织样品（藏猪40 头份，滇南小耳猪37 头份，大约克猪35 头份），用于基因组DNA 的提取。选择6 月龄藏猪、滇南小耳猪和大约克猪各9 头进行屠宰，分别采集背脂、背最长肌和肝脏组织，立即放入RNA-Later 保存液，液氮速冻，用于总RNA 的提取。

1.2 cDNA 的合成及DNA 的提取 RNA 提取采用Trizol法（Trizol Reagent,Invitrogen）提取实验猪背脂、背最长肌及肝脏组织的总RNA。用1% 琼脂糖凝胶电泳法和Nano Drop 2000 分光光度计检测RNA 浓度和质量，-80℃低温冰箱保存。

cDNA 合成利用FastKing RT Kit（With gDNase）快速反转录试剂盒（天根）。先配制gDNA 去除反应体系：加入5×gDNA Buffer 2 μL，根据RNA 浓度计算配比量，用RNase-free Water补足10 μL，42℃孵育3 min；配制反转录反应体系10 μL：10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNasefree Water 5 μL，混匀后加入到去除gDNA反应体系中，充分混匀后42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，-20℃保存。

DNA 提取采用苯酚氯仿抽提法从耳缘组织中提取基因组DNA，用1% 琼脂糖凝胶电泳法和Nano Drop 2000 超微量分光光度计检测DNA 浓度和质量，RNase Free Water 溶解，-20℃保存。

1.3 定量PCR 引物设计与合成 根据NCBI 公布的ELOVL6基因的mRNA 序列（登录号：XR_305072），选用HPRT（登录号：NM_001032376）为内参基因。采用Primer Premier 5.0 软件设计引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用0.1%DEPC 水溶解，4℃保存。

1.4 定量PCR 以cDNA 为模板，用表1 中引物扩增ELOVL6基因和HPRT基因片段，PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用SYBR Green 定量PCR 试剂盒（天根）在实时荧光定量PCR 仪（罗氏，Light Cycler96）进行扩增。对背脂、背最长肌和肝脏组织cDNA 样品进行定量PCR，每个样品设3 个重复并设置标准样和空白样。样品目的基因的表达量采用2-ΔΔCT法计算：

ΔCT(样品)=CT(样品目的基因)-CT(样品内参基因)

ΔCT(标准样)=CT(标准样目的基因)-CT(标准样内参基因)

ΔΔCT=ΔCT(样品)-ΔCT(标准样)

目的基因表达量=2-ΔΔCT

1.5 基因频率与基因型频率 根据NCBI 上已公布的ELOVL6基因Intron 3 的序列（登录号：NC_010450）设计引物（表2）。分别对藏猪、滇南小耳猪及大约克猪的基因组DNA 进行特异性扩增，每10 个样品产物均匀混池，进行测序，初步筛选SNPs 位点后进行单个个体测序，统计分析基因频率与基因型频率。

1.6 统计分析 用SPSS 17.0 软件对ELOVL6基因表达量进行双因素（品种和组织）方差分析，并进行Ducan's 多重比较；对ELOVL6基因的基因型频率和基因频率进行卡方检验，P＜0.05 时差异显著，P＜0.01 时差异极显著，P＞0.05 无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 RNA 和DNA 提取结果 图1、图2 分别为RNA 提取和DNA 提取结果的琼脂糖凝胶电泳检测胶图。在图1 中，28S 和18S 条带清晰，无降解和DNA 污染；在图2 中，DNA 浓度适中，条带清晰，无明显拖尾。通过Nano Drop 2000 分光光度计检测RNA 和DNA，OD值均在2.0 左右，无蛋白等污染，提取质量较高，满足后续实验要求。

表1 基因定量的引物序列

表2 直接测序法筛选SNPs 的引物序列

2.2 猪ELOVL6基因mRNA 定量 如图3 所示，在相同品种的不同组织中，背脂组织ELOVL6基因mRNA表达量最高，其次是背最长肌，肝脏组织表达量最低；在相同组织的不同品种中，背脂和背最长肌组织3 个猪种间差异极显著，其中藏猪表达量最高，其次是滇南小耳猪，大约克猪则最低；在肝脏组织中，该基因在藏猪和滇南小耳猪的表达量均极显著高于大约克猪，藏猪和滇南小耳猪差异不显著。

2.3 猪ELOVL6基因的基因型频率和基因频率分布 藏猪、滇南小耳猪、大约克猪个体测序后，经软件Chromas Pro 和SPSS17.0 分析，在Intron 3 区域存在'G99954A、'G99793A、'G99650A 共3 个SNPs 位点，均符合哈迪-温伯格定律，且为连锁突变（见表3）。结果如表4 所示，在'G99954A、'G99793A、'G99650A 3 个位点中，藏猪、滇南小耳猪均与大约克猪存在极显著差异，藏猪与滇南小耳猪差异不显著。

3 讨 论

ELOVL6 是动物机体内脂肪酸生成和代谢过程中的关键调控因子，也是长链不饱和脂肪酸生物合成的限速酶[12-13]。目前，大量对ELOVL6基因的研究集中在糖尿病及胰岛素抵抗的调节作用上[14-15]。近年来，ELOVL6基因在脂肪生成方面的研究也取得了一些成果，如胡忠昌[16]等通过克隆延黄牛ELOVL6基因技术发现ELOVL6基因可能是影响牛相关脂肪酸代谢的关键调控基因；黄万龙等[17]通过转录组学分析鉴定发现ELOVL6基因在脂肪酸代谢通路上发挥关键作用；Hiroki[18]等在基因缺失小鼠上发现ELOVL6基因缺失对心肌长链脂肪酸成分影响显著，ELOVL6可以驱动细胞内LCFA 组合物在压力超负荷期间通过激活AMPK/KLF4 轴（一种新鉴定的控制心脏表型的信号传导途径）调节肥大反应的新作用。因此，可以推测ELOVL6基因可以调控脂肪沉积，与脂肪的生成有关。

本实验首次对藏猪、滇南小耳猪、大白猪的ELOVL6基因mRNA 表达量进行了检测，结果表明，在背脂和背最长肌中，藏猪＞滇南小耳猪＞大白猪且均存在极显著差异；在肝脏中，藏猪极显著高于大白猪，滇南小耳猪极显著高于大白猪；在猪的ELOVL6基因Intron3 区域，发现有'G99954A、'G99793A、'G99650A 3 个连锁突变位点，体现为藏猪、滇南小耳猪均与大约克猪存在极显著差异，藏猪与滇南小耳猪差异不显著。由此可以看出，ELOVL6基因在国内脂肪型地方品种中，其表达量均高于外来瘦肉型品种。Zhang 等[19]通过GEAS 技术对国内外不同品种猪的肌内脂肪进行了研究，发现猪脂肪含量高时，ELOVL6等基因的表达量高，与本实验所得定量结果一致，进一步证实了ELOVL6基因的表达与脂肪沉积能力呈正相关。藏猪肉质鲜美，口感好，主要由于藏猪肉肌内脂肪含量较高[20]。根据RT-qPCR 结果显示，在不同品种猪中，藏猪背最长肌中ELOVL6基因表达量最高，可能与其肌内脂肪含量和肌纤维分化有关，说明ELOVL6基因在肌肉中的表达量越高，肌内脂肪含量就越高，从而影响肉品质。联合多态性位点和荧光定量PCR 结果，'G99954A、'G99793A、'G99650A 3 个SNPs 位点的多态性与RT-qPCR 结果基本一致，而RTqPCR 结果与猪品种类型显著关联。因此，本实验提示，ELOVL6基因'G99954A、'G99793A、'G99650A 的3 个位点的连锁突变可能是调控猪肌肉生长、脂肪沉积性状的关键功能位点，对开发肉质性状的遗传标记及利用分子标记实现优质猪肉的选育有很大应用意义。

表3 不同品种猪3 个SNP 位点的基因型频率和基因频率

表4 不同品种猪突变位点的差异性

4 结 论

本实验利用RT-qPCR 和一代测序技术，围绕ELOVL6基因，从不同品种猪其生长发育密切相关的3 个组织器官着手，探究了ELOVL6基因Intron 3 区域的多态性及mRNA 表达差异的关联分析，发现ELOVL6基因'G99954A、'G99793A、'G99650A 位点的多态性与mRNA 表达差异性相关。本实验提示，ELOVL6基因的3 个连锁突变位点可能是调控ELOVL6基因表达的关键功能位点，为优质肉质性状的开发提供科学材料，也为优质猪遗传选育工作提供可靠依据。