特异性遗传标记及其在动物源性食品追溯体系中应用的研究进展

高振东，何 俊

（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128）

自20 世纪90 年代以来，在食品从生产到消费的过程链中，可追溯体系的作用日趋凸显，尤其是对动物性食品安全的重要性，引起了全世界的极大关注。诸多食品质量安全问题，如从世界第一例“疯牛病（BSE）”开始，比利时多氯联苯二恶瑛事件、丹麦肉类沙门氏菌污染、新西兰奶粉肉毒杆菌等肉类食品安全事件的发生，严重降低了消费者对动物性食品安全的信任度，动摇了消费者的信心，不利于畜牧业和社会经济发展[1]。在从农场到餐桌的供需消费链中，越来越复杂的加工过程使得在最终产品中很难识别最初原材料，且该过程中可能还涉及到不同的运输和处理方式，牵涉多家工厂以及公司、企业甚至多个国家[2]。其次，我国作为肉品消费大国，优质肉类逐渐成为消费需求增长点，不法商家趁机谋取利益，使用违规添加剂，导致药物、重金属和抗生素等残留，以至出现以次充好和假冒伪劣产品泛滥等诸多案例[3]。

为保障消费者的知情权，避免多个连续步骤中不必要的重复测量，使特殊原材料或功能产品（如优质肉类、蛋类产品）的销售过程得到有效监督，满足当前和未来的消费需求（如确认原产地）以及加强对地方品种的保护与研究等，构建完善的动物性食品追溯体系亟待解决。完善的动物性食品追溯体系中需要保持详细的个体信息、生产加工信息、物流运输信息、分装销售信息等信息流同步一致，最终将汇集信息存储到中央管理平台，建立完整的动物个体信息数据库，保障整个产品生产链各环节可跟踪与最终产品的可追溯性。标记作为能够贯穿动物性食品生产链的唯一手段，标记技术的好坏尤为重要，生产加工过程中如果出现标记遗落或出错，造成产品信息丢失或错漏则会导致追溯链断裂，追溯体系就变得毫无意义，进而造成这些动物性食品安全无法保障[4-5]。因此，标记的稳定性和唯一性将直接决定追溯体系的准确性。

本文综述了不同的追溯标记在追溯体系中的应用情况，分析了生物学特异性遗传标记的追溯能力差异，并总结了追溯能力最强的SNP 标记技术对物种个体基因组构成的物种起源追溯相关研究进展，以期为开发利用稳定的特异性遗传标记并构建完善的动物源性追溯体系提供参考。

1 追溯标记的种类及其应用

目前可用于动物追溯的标记技术主要分为非生物学方法和生物学方法两大类。非生物学标记主要包括形态学标记、物理标记和理化标记；主要的生物学方法有虹膜识别和DNA 遗传标记等。

1.1 非生物学追溯标记及其应用 形态标记主要是利用动物可见或可测量的外部特征（如皮肤、外形、毛色、体型等）进行追溯；物理标记主要是应用机械方法（纹身、烙印、刺青等）、商品条形码技术、无线射频识别技术（Radio Frequency Identification，RFID）等进行溯源；理化标记主要有近红外线光谱技术、蛋白质分析、同位素检测等。

在物理标记应用方面，21 世纪初，上海市、台湾省、北京市和山东省在畜禽和食品的安全追溯中均以使用了RFID 技术[6]；安徽省在猪肉生产中使用RFID 标记对饲养和屠宰过程中的信息进行自动采集，采用条形码对分割肉进行标记，并结合追溯信息体系网络，初步建成了猪肉生产追溯管理体系[7]；石玉芳等[8]利用二维条码结合标记转换技术、数据同步技术等，对二维条码技术在农产品溯源过程进行应用分析，同时实现了商品猪出生到零售全过程的追溯和管理。

在理化标记应用上，徐文杰等[9]应用近红外光谱分析技术对淡水鱼进行了品种的判别分类研究；孙淑敏等[10]应用近红外光谱分析技术对5 个地区羊肉产地进行研究，实现了不同物种以及肉类产地的准确溯源（准确率均高于91%）；Slattery 等[11]利用可溶性肌蛋白对新鲜肉牛肉和水牛肉、红袋鼠肉和灰袋鼠肉的种类进行了精准鉴定，同时利用酯酶同工酶图谱成功区分鉴别新鲜绵羊肉和山羊肉、马肉和驴肉。目前，稳定性同位素指纹也是食品产地溯源的有效手段[12]。Camin 等[13]发现来自不同地区的羔羊肉样的多元素（δ2H、δ13C、δ15N、δ34S）同位素比率之间存在显着差异。Sacco等[14]和孙淑敏等[15]比较不同地域羊组织中稳定性同位素组成的差异，发现稳定性δ13C、δ15N同位素比率可以100%判别羊肉肉样的地域来源。

然而在复杂的动物养殖、生产加工和销售过程中，由于涉及屠宰、分割等复杂过程，非生物学追溯标记在追溯链中应用受限：①形态学标记基于个体性状描述动物个体，无法科学区分不同个体，不能作为追溯标记在追溯链中应用；②物理标记在追溯链中容易出现标记污染、遗漏、人工失误甚至信息作假；③理化标记易受肉样质量和外界环境等因素的影响，且检出过程繁琐复杂。非生物标记由于缺乏稳定性和唯一性，在追溯链中追溯能力明显不能满足目前的食品追溯需求。

1.2 生物学追溯标记及其应用

1.2.1 虹膜识别技术 虹膜特殊的生理结构，被认为是目前最可靠、最有前途的生物特征识别技术之一[16-18]。虹膜结构由遗传基因决定，其纹理特征具有唯一性、高度稳定性，发育稳定后可以保持数十年几乎无变化。这些特点决定了虹膜标记不易被复制、伪造或更改，在追溯体系中能有效鉴别物种及个体的唯一性。

我国虹膜识别技术起步较晚，2000—2013 年才逐渐形成自主核心体系，将虹膜识别技术应用到动物生产追溯体系中，保障动物生产和食品安全。方超等[19]以奶牛为例，概述了采用虹膜识别技术进行个体追溯，并详细介绍了构建基于虹膜识别技术的肉类食品追溯体系的系统流程。Suzaki 等[20]基于100 组马的虹膜数据的识别实验表明，虹膜识别技术可以进行高精度的马个体身份识别，即可利用虹膜识别技术建立马个体鉴别体系。

但虹膜识别技术在实际运用中也存在不足：①大型动物在图像采集时很难保持静止，导致采集过程中图像错位和失焦，使图像质量往往较差；②虹膜信息在瞳孔散大和瞳孔缩小时显著不同[20]；③相较于条码标记和RFID 标记等非生物学方式，虹膜识别技术虽然准确率很高，数据信息准确，但成本、技术要求较高，在大型动物中操作难度较大，且只适用于动物活体追溯。因此，虹膜识别技术在动物性食品的终端消费追溯中受到严重制约，但在濒危及稀有动物的保护中具有很大的开发潜力。鉴于以上因素，虹膜识别技术虽还没能进入大范围使用阶段，但在种畜引入、禽类活体交易追溯中有较大的应用前景。

1.2.2 DNA 遗传标记技术 DNA 标记作为新一代遗传标记技术，是对未知动物源性食品进行科学鉴别并弥补当前动物追溯体系不足的最优标记。从理论上讲，只要原产地留有DNA 标记，所有个体都可通过DNA 识别体系追溯到原产地[21]。近年来，国内外已经将DNA 遗传标记作为标记手段在动物追溯中使用。常用的DNA遗传标记技术有6 种。

1）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）。RFLP 是最早出现的以DNA 杂交为基础的第一代遗传标记，其标记位点数量不受限制，结果稳定可靠，可重复性好，适合构建遗传连锁图谱，对未知肉样进行物种鉴别研究应用于追溯体系中[5]。但在使用中，RFLP 存在一些缺陷，如构建DNA 探针步骤繁琐耗时，DNA 质量要求较高，且接触放射性物质，存在安全隐患，成本过高等，因此将PCR与RFLP 技术结合应用于动物追溯中，更加简易安全。利用PCR-RFLP 技术对鲶鱼、鲑鱼和比目鱼进行分析，不论是冷冻、烟熏或热处理，该技术都能完美鉴别各鱼肉所属物种，是快速鉴定水产肉样和检测商品造假的有效且经济的工具[22-24]。该技术还能准确鉴定牛、猪、羊、鸡源性成分，且不受常用烹饪方法的干扰，检测准确性达100%[25]。但由于PCR-RFLP 技术产出带型简单，多态性不足，仅能鉴别未知肉样所属物种，追溯能力不足以精确到个体信息，因此更适用于物种鉴定。

2）随机扩增多态DNA（Randomly Amplified Poly morphic DNA，RAPD）。RAPD 技术利用RFLP 的可靠性和PCR 的高效性，对基因组DNA 酶切片段进行选择性扩增，对于不同基因组DNA，用同一引物扩增即可得到不同带型进行分子标记研究。由于其扩增产物的多态性即可反映基因组的多态性，引物可随机合成和随机选定，具有简便易行（不需要RFLP 分析的预备性工作）且所需DNA 量少等优势，RAPD 技术也能通过动植物的品种（系）和类群鉴定研究应用于追溯体系中。刘德武等[26]用RAPD 标记对6 个品种猪进行了群体遗传结构分析，在140 个10 碱基随机引物的扩增产物中筛选出9 个特异性强的引物进行个体DNA 的RAPD 分析，聚类分析结果显示特异引物扩增产物可明显鉴别外来猪种和地方猪种。林建新等[27]利用4 个单种引物对羚牛、家牛和黑熊进行区分，成功构建羚牛、家牛和黑熊DNA 指纹图谱。由于RAPD 技术能对整个基因组进行多态性检测，因此只要筛选到合适的引物，就可找到品种、品系或群体的特征性的RAPD 标记，但依然无法精确到个体，因此更适于进行品种（系）或类群的鉴定。

3）扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）。AFLP 是RFLP 与RAPD 相结合的产物，结合PCR 引物与接头序列识别进行扩增，具有高效、快速、稳定、DNA 用量少、多态性检出率高、重复性好的特点，通过对动植物的种质鉴定构建遗传图谱应用于追溯体系中。Zhao 等[28]使用AFLP 鉴定中国市场中最具代表性的6 个牛品种的89 个个体，8 对引物组合共产生1 095 个多态性片段，UPGMA（Unweighted Pair-Group Method With Arithmetic Means）聚类分析、PLS-DA 分析后，建立每个样品的独特AFLP 指纹，成功区分所有检测个体，使之可追溯。大量实验表明，AFLP 标记在物种的种质鉴别中更加高效便捷，如果2种或多种组合引物一起使用，可以预期AFLP 方法能在更大的样本量下获得优异的结果，并有助于建立高质量可追溯体系，贯穿整个食品供应链。

4）线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mt DNA）。mt DNA 作为细胞质内的遗传物质，因其分子结构简单、稳定母系遗传、世代间不出现基因重组、进化速率高等原因，导致mt DNA 比核DNA 更易受遗传漂变的影响[29-30]。其中线粒体DNA 控制区又称为替代环区（Displacement-Loop Region，D-loop），是mt DNA 中碱基序列和长度变异最大、最主要的一段非编码区，因此mt DNA D-loop 序列被广泛用于遗传多样性及起源进化关系的研究[31]。

Larson[32]采集了324 头来自40 个国家的80 个代表现代家猪品种和362 头来自不同地区的野猪样本，利用mt DNA 研究猪的驯化起源，结果显示东南亚拥有最古老的野猪群体，然后逐渐分散至欧亚大陆，揭示了家猪的多点起源。杜金花等[33]、李义书等[34]基于mt DNA D-loop 区序列分析了彭县黄鸡和儋州鸡的遗传多样性及其起源进化关系，结果表明彭县黄鸡、儋州鸡均为3 个母系起源且遗传多样性较低，研究为评估和保护地方品种的遗传多样性提供了理论依据。由于mt DNA严格的母系遗传方式和进化快、无重组等特点，仅能够准确追溯物种所属家系，因此更适于用作追溯物种遗传多样性起源研究。

5）简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）。SSR 也称微卫星DNA，即一段简单的核苷酸重复序列，串联重复的核心序列为1～6 bp，串联数目的不同导致SSR 具有高度多态性（突变率一般在10-3～10-6），由于核心序列串联重复数目不同，使扩增出的PCR 产物不同，凝胶电泳后根据不同片段大小区分不同基因型。由于SSR 含量丰富且具有高度多态性等特点，因而十分适用于进行个体识别、亲缘关系鉴定、估测动物种群的育种历史与迁徙路线等方面[35-36]。吴潇等[37]、阮泓越等[38]、Zhao 等[39]利用微卫星多态性检测，在不同猪种和肉牛中分别筛选11、14、16 个特异性SSR 标记，可以成功区分不同品种的所有个体，并对不同组织进行验证，匹配准确率高达100%。Dalvit 等[40]验证和测试了一组12 个SSR 标记，用于评估6 个牛品种的遗传可追溯体系，结果显示其中5 个最具多态性的基因座的区分率为95%。由此可见，SSR 标记不仅能够准确追溯肉样物种，同时还能准确识别肉样个体，追溯能力强，但SSR 标记存在多态性丰富导致产出带型复杂，不利于识别自动化与规模化等缺点。

6）单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）SNP 标记是诞生于1996 年的第3 代遗传标记[41]，是指基因组在同一位点上包括转换、颠换、缺失和插入的单个核苷酸的变异，多态性丰富且数量大。Stephens 等[42]在人类近720 kb 的基因组序列中发现了3 899 个多态性位点，大约平均185 个碱基中便有1 个SNP。SNP具有多态性丰富且数量大、遗传稳定、检出速度快，质量高、能实现自动化和规模化检测等优点，其二态性也利于基因分型，是当前追溯体系中最重要、最有效的遗传标记技术。张小波等[43]、龙毅等[44]、Heaton 等[45]、Goffaux 等[1]利用SNP 标记在不同猪种和绵羊中进行遗传可追溯性研究，分别筛选出6 SNPs、16 SNPs、163 SNPs、21 SNPs 可用作DNA 追溯遗传标记，验证分析结果显示区分效力和准确度均大于99%。Negrini 等[46]将SNP 与贝叶斯统计数据结合用于牛的地理可追溯性，对来自不同国家的24 个品种牛肉产品进行鉴别，个体识别到原产地的准确率为93%，其中对4 种欧洲地标性纯种高原牛肉鉴别准确率为100%。

SNP 标记非此即彼的二态性，使SNP 的基因分型结果能够方便采用数字化、标准化表示；虽然SNP 标记多态性低于SSR 标记，但SNP 标记可以通过增加标记位点数量来弥补多态性不足的问题。综合考虑，与其他标记相比，SNP 标记终将成为追溯体系中最热门，也是最有效的遗传标记。

不同DNA 分子标记在追溯体系中的比较如表1 所示。

1.2.3 SNP 芯片技术的发展及在追溯体系中的应用 高通量测序技术和计算机技术的发展使大规模获得畜禽基因组SNP 信息的成本越来越低，测定密度也越来越高，SNP 芯片技术广泛应用于动物遗传追溯体系[51]。由于SNPs 在种群间基因频率差异显著，数量多、遗传稳定性高，且随着SNP 芯片技术的应用，成为近年来筛选个体识别SNPs（Individual Identification SNPs，IISNPs）位点和祖先信息SNPs（Ancestry Informative SNPs，AISNPs）位点、分析种群遗传结构的重要遗传标记[52]。因此SNP 标记在追溯体系中不仅能做到物种识别和个体鉴别，还能揭示动物个体基因组品种构成（Genomic Breed Composition，GBC）、解析动物驯化、品种培育和群体迁徙事件之间的历史关系。

王小鹏[53]对29 个中国地方猪种、2 个培育品种和4 个西方猪种共2 856 个个体进行60K SNP 芯片测序分型后进行遗传距离、遗传分化和种群结构分析，最后通过主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和构建邻接法进化树（Neighbor-Joining tree，NJ-tree），筛选出80、100、100、120 个SNPs 分别鉴别西方猪种与中国地方猪种、二花脸猪与其他猪种、莱芜猪与其他猪种、苏太猪与其他猪种，并利用验证群体对标记应用效果进行验证，PCA 与NJ-tree 的区分效力均达到99.0%以上，上述不同特异性SNPs 标记分别构建了中国地方猪种、二花脸猪、莱芜猪、苏太猪的高质量品种特异性遗传标记，为准确鉴别和追溯中国地方猪种、二花脸猪、莱芜猪、苏太猪提供了一个切实可行的方法。Dimauro 等[54]使用Illumina 50K SNP 芯片对意大利的3 种种公牛（荷斯坦、布朗和西门塔尔牛）进行基因分型，最后选择了一组48 个高判别性SNP，能准确识别3 个品种并正确追踪个体。Ramos 等[55]使用Illumina 60K SNP 芯片对构建5 个猪种的品种特异性SNP 芯片进行实验研究，鉴定出29 146 个可能品种特异性SNP，其中4 441 个包含在Porcine SNP60 微珠芯片中，与beadchip 检测结果对比后，最终确认了193个SNP 具有品种特异性，在同一群体的另外490 个个体进行验证，平均检出率为99.2%；同时研究也表明，品种特异性遗传标记的可追溯性具有很高的实用性，并证明了SNP 标记可用于物种鉴别和追溯动物物种起源。

表1 DNA 分子标记在追溯体系中的比较[1,47-50]

Colli 等[56]利用90K SNP 密度芯片对10 种河流型水牛与5 种沼泽型水牛进行了分子多样性水平和种群结构分析，在纯河流和纯沼泽水牛群体中鉴定出3 个不同的基因库，追溯了种群和迁徙事件之间的历史关系，结果显示河流型和沼泽型水牛均起源于中国、印度、巴基斯坦境内。在山羊的研究中[57]，验证并揭示了山羊起源于土耳其和伊朗一带，并通过不同的迁徙路线传播到欧洲、非洲和亚洲，由于地理和生殖隔离导致了多样性的区域子结构。该研究不仅成功追溯山羊种群及其历史迁徙变化，并为保持山羊基因多样性提供了科学理论依据。

同时，利用SNP芯片可估计动物个体的GBC（Genomic Breed Composition），可反映出每个品种（祖先）对于动物个体基因组的遗传贡献比例，即可追溯该动物所在群体的培育历史。已经在合成品种布兰格斯肉牛（Brangus）和牛肉王牛（Beefmaster）中验证了它们不同祖先品种的血统构成，并计算了祖先品种对合成品种每个动物个体的遗传贡献比例[58]；同时采用SNP 子集混合模型估计牛的GBC，结果显示，在198 头日本红毛和牛（Akaushi）中，5 个SNP 子集在估计GBC 方面表现相似，但1K SNP 子集估算GBC 的性价比最高，且还能通过减少SNP 数量达到节约成本的目的[59]。

2 结语与展望

如今，动物生产中面临着较大的疫病风险，肉类安全问题已经威胁到生产者和消费者的切身利益，因此构建和完善动物追溯体系至关重要。良好的追溯标记作为能够贯穿跟踪整个动物生产链的主要手段，其稳定性和唯一性直接决定追溯体系的追踪能力。DNA 标记作为最具优势的新一代遗传标记技术，就像嵌入动物体的隐形身份证，具有高度的稳定性与唯一性，不会出现遗失、假冒、损坏现象，是解决当前动物追溯体系中标记稳定性缺乏的最好方法。

然而DNA 标记由于多态性不同导致追溯能力存在差异。在遗传追溯方面，PCR-RFLP、RAPD 标记由于多态性不足，仅能对不同物种或品系进行鉴别；AFLP标记虽能追溯至不同的物种与个体，但大规模使用需要多组合引物量较大，因此只能在小范围实现；mt DNA由于独特的遗传方式，仅能用于鉴别物种家系与遗传多样性起源研究；SSR 和SNP 2 种标记不仅能准确鉴别不同肉样所属物种，且能追溯不同肉样个体，追溯效果十分接近，但SSR 标记在追溯时无法准确鉴别动物全同胞个体，追溯能力相对低于SNP 标记。SNP 标记在遗传追溯技术体系中的优势明显，不仅能用于品种层次的遗传标记构建，同时也能用于个体层次遗传身份证的构建，加上SNP 芯片技术的商业化应用，利用高密度芯片筛选并构建个体或品种特异性遗传标记，便可设计低密度芯片应用于整个追溯体系，即使同卵孪生，也可有效区分，且能在不影响准确率的同时有效降低成本。

综上所述，随着动物食品安全的社会需要和生物技术的发展，DNA 遗传追溯定会成为动物食品安全追溯技术研究和发展的必然选择。而基于基因组信息构建的遗传身份证是动物及其产品个体鉴别和物种识别最精确且可靠的追溯技术。其中SNP 标记作为追溯标记中最具稳定性与准确性的DNA 标记技术，早已成为国内外遗传追溯研究的热门标记方法，随着SNP 芯片技术的成熟和成本的不断降低，其实用性和应用价值也愈发高涨。因此，由SNP 芯片构建品种特异性遗传标签和个体遗传身份证的遗传追溯技术将拥有巨大的市场应用潜力。