动物脂肪组织相关miRNAs 的研究进展

张琦悦，何 春，孙浩玮，庞卫军

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

白色脂肪组织（WAT）是动物机体中良好的储能与供能物质，还可以作为分泌器官合成多种脂肪因子，调节机体的生理、病理状态[1]。对于家畜而言，适量的脂肪组织不仅可以保证家畜机体健康，还可改善肉的风味[2]。阐明调控脂肪形成过程中的分子机制对于畜牧业及肉类生产行业都至关重要。miRNA 作为一个重要的调节因子，可通过调控靶mRNA 的翻译与稳定性，进而促进或抑制成脂相关基因的表达，在脂肪形成过程中发挥重要作用。在家畜肉品质改良方面，目前有大量研究集中于从营养角度调控脂质的合成与代谢过程，而在遗传发育方面的分子调节机制研究相对较少。本文总结miRNA 的生物学特性及作用机制，综合分析近年来与脂肪组织相关的miRNA 的重要研究，并对其未来的发展进行展望。

1 miRNA 概述

miRNA 的发现经历了数十年的时间。最早探索到的miRNA 是Lee 等[3]于1993 年在线虫研究中克隆出来的，具有调节线虫发育的功能。但这项研究并未引起科学界的重视，直到2000 年Ruvkun[4]在线虫研究中又发现一个相似的miRNA——let-7，这2 个非编码基因都可以通过与基因3'-UTR 结合发挥调控作用。自此人们意识到这种小RNA 可能是机体中广泛存在的一种调节因子。2001 年此类小RNA 被正式命名为microRNA，简称为miRNA[5]。随后多种miRNA 在不同物种中被发现，并证实可以调控各种重要的生理活动，同时对于miRNA 的生物学本质与作用机制的研究也逐渐明朗。

1.1 miRNA 的来源 机体内绝大多数miRNA 为内源性RNA，其中编码基因位于内含子区并与宿主基因共同受到上游启动子调控的称为内含子miRNA；位于基因间隔区并可以独立转录的称为基因间miRNA[6]。机体中还可能存在一定水平的外源性miRNA[7-8]。Zhang等[8]在各种动物的血液和组织中均检测到了植物源性miRNA，并鉴定出其中的MIR168a 能够通过靶向低密度脂蛋白受体配体蛋白1（LDL Receptor Ligand Protein 1，LDLRAP1）影响肝脏正常功能，不过目前该项研究仍存在一定争议。

1.2 miRNA 的合成 miRNA 的经典合成过程如图1 所示，首先miRNA 的基因组DNA 借助RNA 聚合酶Ⅱ（少数借助于RNA 聚合酶Ⅲ）转录为长达几千nt 的primiRNA[9]。随后在2 次核酸内切酶的切割作用下最终形成成熟的miRNA[10]：第一次切割发生在细胞核中，是由Drosha 酶将pri-miRNA 从初始转录本上切割下来形成pre-miRNA。pre-miRNA 通过细胞核转运蛋白EXP5介导转运至细胞质中，在细胞质中被Dicer 酶二次切割为长度约22 nt 的双链RNA[10]。Drosha 酶与Dicer 酶的切割具有相同的特点，即在切口处形成2 nt 的悬垂（Overhang）结构，利于其装载到沉默诱导复合体（RNAInduced Silencing Complex，RSIC）上，RSIC 中的双链RNA 要经历最后一步的选择机制，双链中5'端相对不稳定的一条链倾向于被保留（称作向导链），而另一条链则会被迅速降解（称作随从链）[11]。

1.3 miRNA 的作用机制 miRNA 需要被装配到RSCI中才能行使其调控基因表达的功能。被结合的靶mRNA一般有3 种命运：①翻译抑制。RISC 通过2 方面发挥抑制作用，一方面在翻译起始之前抑制核糖体形成，从而阻止翻译起始[12]；另一方面在翻译过程中阻止核糖体前进，导致翻译终止[13]。②靶mRNA 的降解。RSCI可以抑制靶基因的正常转录，使靶mRNA 脱帽、脱尾最终降解[14]。③靶mRNA 的切割。RSIC 中的Ago2 可发挥切割作用[15]。其中要实现靶mRNA 切割需满足2个条件：miRNA 被Ago2 蛋白紧密包裹且与靶mRNA完美匹配。miRNA 通过自身种子序列与靶mRNA 不同程度地结合，维持机体中蛋白质的最佳水平。

2 影响脂肪细胞分化的miRNAs

脂肪细胞是动态且高度受调控的细胞群，脂肪生成是一个多步骤的过程，涉及多种信号通路如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、MAPK、TGFβ/smad 和一些核心转录因子如过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferator-Activated Receptors，PPARs）、CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/Enhancer-Binding Proteins，C/EBPs）、固醇调节元素结合蛋白1（Sterol-Regulatory Element Binding Proteins，SREBP1）等的重要调控作用。miRNA 可通过结合相关信号通路中的关键组成元件，或者直接与核心转录因子结合，进而调控成脂标志物，如脂肪酸结合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4，FABP4）、葡萄糖转运子4（Glucose Transporter 4，GLUT4）、脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，FASN）的表达，最终影响脂肪细胞分化。

2.1 miRNA 调控脂肪细胞分化过程中的经典信号通路PI3K/Akt 信号通路促进脂质生物合成并抑制脂解。一些研究表明，miRNA 在PI3K/Akt 信号通路调控脂肪细胞分化过程中发挥重要作用。Akt 是PI3K/Akt 信号通路中c-Met 的下游效应因子，在整个3T3-L1 细胞分化过程中，miRNA-206 可通过抑制靶基因c-Met 的表达，使Akt 磷酸化程度降低，从而抑制脂肪细胞分化[16]。Mi 等[17]研究发现miR-139-5p 可通过直接靶向IRS1/PI3K/Akt 胰岛素信号通路的关键成员IRS1，在脂肪细胞分化中发挥负调节作用。伊璨等[18]研究发现miR-143 可以与多聚营养素（Pleiotrophin，PTN）的3'-UTR结合，在通过PTN/PI3K/AKT 信号途径的脂肪生成过程中起到抑制作用，从而促进人骨髓间充质干细胞的成脂分化。

MAPK 信号通路是由3 个顺序活化的激酶组成的磷酸化系统的一部分并受磷酸化调节。在脂肪细胞分化中，有丝分裂克隆扩增阶段需要MAPK 信号通路的激活，但在终末分化阶段中，MAPKs 通过磷酸化PPARγ抑制脂肪细胞分化[19]。Jin 等[20]研究发现miR-24 在3T3-L1 前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中显著上调，用miR-24-mimics 转染3T3-L1 细胞之后，通过油红O 染色发现，miR-24 过表达组较对照组形成更多的脂滴，此外甘油三酯含量也增加了21.6%，说明miR-24 可以促进脂肪细胞分化，进一步的实验证明MAPK7是miR-24 的直接靶点，miR-24 通过下调MAPK7 表达而发挥其成脂作用。Xie 等[21]实验发现，过表达miR-21a-5p 可减轻双酚A（Bisphenol A，BPA）诱导的体内肥胖，萤光素酶活性测定表明miR-21a-5p 通过靶向Map2K3 抑制BPA 诱导的3T3-L1 成脂分化。

2.2 miRNA 调控脂肪细胞分化过程中的关键转录因子PPARγ是一种配体激活的关键转录因子，在脂肪细胞分化过程中发挥关键作用。PPARγ在脂肪细胞分化早期表达并维持脂肪细胞的终末分化，同时激活脂肪细胞特异基因表达，产生脂肪细胞表型[22]。miR-130 可以同时靶向PPARγmRNA 的编码区和3'-UTR 来有效抑制PPARγ表达，进而减少脂肪形成[23]。在地塞米松诱导的脂质蓄积中，miR-130b 可以直接识别结合PPAR-γ的3'-UTR 并抑制PPARγ的表达，来减轻地塞米松诱导的猪前脂肪细胞脂质蓄积量的增加[24]。

C/EBPs 转录因子家族在脂肪细胞分化过程中发挥重要作用。C/EBPβ和C/EBPδ 是前脂肪细胞暴露于分化培养基后诱导的第一个转录因子，随后诱导C/EBPα表达，C/EBPα充当多种脂肪细胞基因的转录激活因子，促进脂肪细胞分化[25]。Feng 等[26]通过qPCR发现miR-326 在脂肪干细胞（Adipose-Derived Stem Cells，ASC）成脂分化过程中表达量降低，用慢病毒包裹miR-326 转染hASCs 后，发现该处理组较对照组仅有少量脂滴合成，同时C/EBPα蛋白表达下降。通过生物信息学分析，发现C/EBPα的3'-UTR 具有2 个miR-326 的结合位点，进一步实验证实miR-326 通过与C/EBPα结合，降低其表达水平，从而导致hASCs 的成脂分化减少。

3 与脂质代谢相关的miRNAs

脂质代谢包括甘油三酯、胆固醇、磷脂、糖脂的合成与分解，以及脂蛋白代谢等。实验证明，许多miRNA 已成为脂质代谢的重要调节因子，通过靶向脂代谢中的关键酶如乙酰辅酶A 羧化酶（Acetyl CoA Carboxylase，ACAC）以及重要的转录因子如固醇调节元件结合蛋白（Sterol Regulatory Element Binding Proteins，SREBPs）和运输脂类的脂蛋白等发挥其调控作用[27-28]。2003 年，在果蝇中首次描述了miRNA 在脂质代谢中的作用，发现动物体内三酰和二酰甘油含量随miR-14 拷贝数的增加而减少[29]。随后Varghese[30]在果蝇中发现miR-14 可直接靶向大脑中产生胰岛素的分泌细胞中的Sugarbabe。Sugarbabe 编码锌指蛋白，该蛋白可调节神经分泌细胞中的胰岛素基因表达，以控制新陈代谢。

SREBPs 是一类膜结合转录因子，通过控制脂肪酸、磷脂、胆固醇的从头合成以及胆固醇的摄取，在脂质代谢中占据重要地位。SREBP 由SREBP-1a、SREBP-1c 和SREBP-2 3 个成员组成，其中SREBP-2 主要控制胆固醇的合成和摄取，而SREBP-1c 调节脂肪酸的合成。SREBP-1a 兼具以上3 种功能[31-32]。Yang 等[33]发现在HepG2 细胞中过表达miR-185 可抑制SREBP-2基因的表达并降低其蛋白质水平，同时导致LDL 摄取和HMG-CoA 还原酶活性降低。Geng 等[34]首次证明了miR-98 通过直接靶向SREBP-2 使细胞内总胆固醇水平降低，阐明miR-98 在胆固醇代谢中的新作用。

另外miR-122[35]、miR-370[36]、miR-758[37]、miR-27[38]、miR-30c[39]、miR223[40]、miR-144[41]、miR168a[8]、miR-302a[42]、miR378[43]等对脂质代谢过程同样起到调控作用。

4 脂肪组织来源的循环miRNAs

动物体成熟的miRNA 在细胞内部形成并发挥功能，同时还可被释放到动物的循环系统和各种体液中[44]。miRNA 可以包装在一类被称为细胞外囊泡的结构中，这些囊泡包括外泌体和微囊泡，是细胞衍生的膜状结构，其中包含许多miRNA，既具有旁分泌的作用，又可以作为内分泌因子，在细胞之间转移，从而建立细胞间通讯以及在远处的器官之间传播以促进器官间的物质和信息交流[45-46]。

脂肪组织是循环miRNA 的主要来源，脂肪来源的循环miRNA 可以认作为一类新型的脂肪因子。Thomas等[47]研究发现，在miRNA 加工酶Dicer 脂肪特异性敲除（ADicerKO）的小鼠以及患有脂肪营养不良的人类中，其循环性外泌体miRNA 都有很大程度减少，而接受白色特别是棕色脂肪组织（BAT）移植的ADicerKO 小鼠，体液中循环miRNA 含量可以达到野生型水平，同时还提高了其葡萄糖耐受性，这是首次研究报道脂肪来源的miRNA 是机体中所有循环miRNA 的重要来源。

脂肪组织中的主要细胞群是脂肪细胞，其他的常驻细胞包括巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞等。脂肪组织中巨噬细胞相对于其他细胞类型的比例可以从瘦肉型个体的5%上升到肥胖型个体的50%[48]。研究发现，脂肪组织巨噬细胞（Adipose Tissue Macrophages，ATM）可以将含有miRNA 的外泌体（Exosomes，Exos）分泌到循环系统中，进而调节机体对胰岛素的敏感性[49]。来自肥胖动物的ATM 分泌的Exos，其中所包含的miRNA 可以在体内和体外被胰岛素靶细胞吸收，从而导致细胞和全身性的胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良，而在体内和体外使用瘦小鼠衍生的ATM-Exos 对肥胖个体进行治疗，相关症状可得到明显改善[49-50]。进一步研究发现，miR-155 是二者ATM-Exos 中差异表达的miRNA之一，可以通过直接抑制其靶基因PPARγ来影响肥胖个体中胰岛素信号的传导并降低其葡萄糖耐受量[50]。

大量研究证实，肥胖机体中分泌的miRNA 谱会发生改变，从而影响循环miRNA 的分泌，并可能导致其他代谢器官的病理变化[51-52]。因此肥胖相关和/或脂肪组织衍生的循环miRNA 有成为新型生物标志物的潜力，成为用于治疗肥胖和相关疾病的新靶标[53]。由此发展出的新型疗法，如miRNA 模拟物、抗miRNA 寡核苷酸和装载miRNA 的外泌体，可能使基于miRNA的疗法在肥胖和代谢性疾病中的临床应用成为可能[48]。但循环miRNA 也存在一定缺陷。在动物模型中，可能是多个循环miRNA 以协调工作的方式来控制新陈代谢，而单个特异性循环miRNA 往往对代谢的影响较弱，另外，由于存在大量的未知靶点，循环miRNA 的靶向特异性较差，这可能导致基于miRNA 的治疗出现脱靶不良反应[54]。但这种以新形式存在并发挥作用的miRNA，依然为脂肪相关研究提供了新思路。

5 总结及展望

近年来，关于脂肪组织中miRNA 的功能研究日趋增多，均旨在阐明miRNA-靶基因-功能三者之间的关系。由于miRNA 与其靶基因并非轴线式的调控关系，而呈现出一个极具复杂性的调控网络，脂肪组织来源的循环miRNA 的发现，也为miRNA 调控网络增添了新的元素。随着高通量测序技术和芯片技术水平不断提高，越来越多的miRNA 被鉴定出具有重要的生物学功能，相关miRNA 靶基因预测软件的研发也大大提高了对miRNA 靶点预测的准确性，然而其中仅有一小部分被证实，目前对于miRNA-靶基因-生物学功能的复杂调控网络的认识还不足。未来将miRNA 作为调控家畜肉品质的靶点，甚至作为生物学标记治疗代谢性疾病具有十分广阔的前景。