Nrf2基因对中波紫外线诱导角质形成细胞光损伤的保护作用

任 静，马良娟

紫外线照射皮肤发生氧化应激反应，从而诱导产生以羟自由基和脂质过氧化物为主的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 可直接导致脂质、蛋白质和核酸的损伤以及皮肤光老化[1]。Nrf2基因是一种含有亮氨酸拉链基本结构的核转录因子，它是机体内重要的氧化应激因子， 以转录调控的方式对抗皮肤细胞的氧化应激，从而在氧化反应中保护细胞免受损害[2]。基于此，本文通过研究中波紫外线（UVB）诱导人永生化角质形成细胞（HaCaT）氧化损伤，观察和评估Nrf2基因对细胞的氧化损伤和光损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 HaCaT 由哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科柏冰雪教授馈赠。

1.1.2 仪器 紫外线光源（南京华强公司）；紫外光强度计（深圳市欣宝瑞仪器有限公司）；超净工作台（哈尔滨市东联生化仪器有限公司）；倒置显微镜（日本Nikon 公司）；iMark 酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；离心机（长沙湘仪公司）；CO2培养箱（上海力康医疗有限公司）；水浴振荡器（哈尔滨东联生化仪器有限公司）；ChemiScope 6000 系列化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.1.3 试剂 PBS 粉剂、CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（日本同仁化学研究所）；DMSO（美国Sigma 公司）；胰酶细胞消化液（上海碧云天公司）；DMEM培养基（美国Hyclone 公司）；胎牛血清（天津康源公司）；Nrf2基因沉默慢病毒包装（上海吉玛公司）；超氧化物阴离子荧光探针、试剂盒、RIPA 裂解液（上海碧云天公司）； BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天公司）；PVDF 膜 （北京Biosharp 公司）；一抗Nrf2 抗体（兔抗人）（日本CST 公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体（美国Proteintech 公司）。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养 HaCaT 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养液置于细胞培养箱中 （37℃、95%湿度及体积分数5%CO2）贴壁培养。传代取对数生长期的HaCaT 细胞，加入胰酶消化液消化后，用含10% 胎牛血清的DMEM 培养基以1×105个/ml 细胞密度接种于6 或96 孔培养板中，待长至50%～60%且处于对数生长，换成无血清培养基，饥饿24 h 后进行实验。

1.2.2 细胞转染 转染具体步骤按慢病毒包装转染试剂说明书进行预实验，确认目的细胞的感染方法和感染复数（MOI）。将细胞接种于6 孔板，进行正式实验。待生长稳定后收集细胞检测Nrf2 沉默效果并培养待用。

1.2.3 细胞分组处理 待HaCaT 细胞融合80%以上后，分为正常组（无UVB 辐射）、UVB 辐射组（采用UVB 辐射）、SiRNA 组（基因沉默，无UVB 辐射）、SiRNA+ UVB 照射组（基因沉默，采用UVB 辐射）。每组细胞均有3 个 复孔，弃去细胞培养基，加入适量PBS 覆盖细胞，再用30 mJ/cm2剂量UVB 辐射。空白对照组需用铝箔覆盖。弃去PBS，加入10%胎牛血清DMEM 培养基于培养箱中继续培养24 h。

1.2.4 测定指标及方法 采用Western blot 法检测Nrf2 表达的变化。主要步骤：收集上述每组孔板里HaCaT 细胞，提取细胞总蛋白后采取BCA 法测蛋白浓度。8%SDS-PAGE 凝胶垂直电泳，采用湿转法将蛋白转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入Nrf2（浓度比分别为1:1 000），4℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 进行孵育，ECL 试剂检测膜上的免疫反应条带，并用ChemiScope 6000 系列化学发光成像系统采集图像、对条带灰度值进行量化分析。以β-肌动蛋白（1:1 000）作为内参照，比较不同处理后上述蛋白表达的差异，实验重复3 次以上。①HaCaT 细胞增殖活性的测定：将细胞接种于96 孔板，按1.2.3 分组处理细胞，每孔加入溶液（按培养基:CCK-8=10:1 的比例提前配好）110 μl，孵育3 h 后弃去上清，于酶标仪450 nm 波长测各孔A值。②细胞内活性氧ROS 含量的测定：UVB 辐射30 min 后收集细胞，弃去原培养基；加入含1 μmol/L DHE 的无血清培养基，于37℃、5%CO2培养箱孵育30 min；用无血清培养液冲洗4 次，使未进入细胞的DHE 得到充分去除。在流式细胞仪上使用535 nm 激发波长和610 nm 发射波长检测DHE 平均荧光强度。

图1 不同MOI值时HaCaT转染情况（×200）

1.3 统计学方法

运用SPSS22.0 软件进行统计学分析。数据用组间比较，采用单因素ANOVA 方差分析。

2 结果

2.1 不同MOI 值时HaCaT 转染情况

从图1 可见，随着MOI 值的增高，绿色荧光阳性的细胞比例逐渐增大（图1a-1d），而MOI 为20 时与MOI 为50 时，细胞转染效率均在50%，符合实验转染要求，选择20 为细胞最合适的MOI。

图2 UVB 照射前后HaCaT 细胞形态变化（×200）

2.2 UVB 照射前后 HaCaT 细胞的形态学变化

倒置光学显微镜下显示正常的 HaCaT 细胞处于对数生长期的形态， 细胞为多角形，呈簇集状生长，生长良好（图 2a）；30 mJ/cm2UVB 照射后继续培养24 h 的 HaCaT 细胞出现皱缩、变圆，数量明显减少（图2b）。NrF2-siRNA 组（基因沉默，不辐射），细胞呈簇集状生长，生长良好（图2c）。Nrf2-siRNA+UVB组（基因沉默后照射30 J/cm2UVB 后继续培养24 h）贴壁细胞明显减少，漂浮死亡的细胞增多，贴壁的细胞部分去正常的膜结构（图2d）。

2.3 各组HaCaT 细胞的活力情况

CCK-8 检测结果显示，各实验组细胞生存率分别为 100%、45.86%、59.66%、15.14%。与正常对照组相比，基因沉默组以及经30 mJ/cm2UVB 照射后的各组细胞的活性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与 UVB 照射组对比，siRNA+UVB 组的细胞活性明显降低，各实验组差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 各组细胞存活率

2.4 各组HaCaT 细胞的活性氧荧光强度

每管内计数约1 万个细胞，计算单个细胞的平均荧光强度（MEAN），P2 为ROS 表达阳性区域。A、B、C、D 分别为正常细胞组、UVB 照射组、SiRNA组、SiRNA+UVB 照射组。与正常组相比，Nrf2基因沉默组ROS 平均荧光强度增加，UVB 照射后细胞ROS 水平明显增高（电轴右偏，MEAN 增强），其中，与正常组相比，UVB 照射组MENA 增加1 倍左右；与SiRNA 组 相 比，SiRNA+UVB 组 的MEAN 增 加幅度在2 倍以上。说明UVB 照射能使细胞ROS 增加，其中Nrf2基因沉默后，再进行UVB 照射细胞的ROS增加更显著，表明细胞损伤程度也更严重（图3）。

2.5 各组HaCaT 细胞中Nrf2 蛋白的表达

稳定转染Nrf2-siRNA 基因的HaCaT 细胞，Nrf2蛋白的表达明显降低，说明慢病毒感染HaCaT 细胞是成功的。与正常组相比，30 mJ/cm2UVB 照射后，HaCaT 细胞中 Nrf2 蛋白的表达降低（图 4）。

3 讨论

UVB 辐射主要是由皮肤吸收的（90%的波长范围内的辐射是由表皮层阻止的），因此它主要影响表皮细胞。在光老化过程中，角质层可能会发生角化过度，表皮干燥、增厚，有皱纹，色素沉着，毛细血管扩张症，皮肤松弛，黑头。临床上，光老化包括日光性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤[3]。紫外线照射皮肤发生氧化应激反应，诱导产生以羟自由基和脂质过氧化物为主的活性氧（ROS），可直接导致脂质、蛋白质和核酸的损伤以及皮肤光老化[1]。抗氧化剂对氧化应激的反应是一种重要的防御机制，可抗内在和外在氧化损伤的有害影响[4]。在本次研究中，实验研究证明 30 mJ/cm2UVB 照射后 24 h，倒置光学显微镜下观察 HaCaT 细胞出现皱缩，贴壁细胞数量明显降低，漂浮细胞增多。CCK-8 的方法检测HaCaT 细胞在不同情况下的存活率，发现经30 mJ/cm2UVB 照射后与正常组相比，细胞的存活率下降。流式细胞仪分析HaCaT 细胞的ROS 荧光强度，发现经30 mJ/cm2UVB 照射后细胞的ROS 平均荧光强度增强。实验证实UVB 能诱导HaCaT 细胞的光损伤。Nrf2 在细胞内的氧化条件下与抗氧化反应原件（antioxidant response elemen，ARE）结合，启动抗氧化基因的转录，诱导转录的与细胞保护有关的抗氧化酶。Nrf2 诱导转录的与细胞保护有关的抗氧化酶包括谷胱甘肽S 转移酶（GST）、醌氧化还原酶(NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）、血红素氧合酶-1（HO-1）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖醛酸转移酶（UDP-UGT）[5-7]，在氧化反应中保护细胞免受损害。对Nrf2基因敲除小鼠进行紫外线照射，其抗氧化基因的表达降低后，氧化应激损伤明显加强，证明 Nrf2-ARE 通路是调控细胞内氧化还原状态的重要途径[8]。在进行大鼠脑缺血再灌注的试验（损伤机制主要是产生的大量自由基与脂质、蛋白质及核酸发生反应，从而导致膜脂质过氧化）时，大鼠脑缺血后再灌注的脑组织中Nrf2 的表达上升，使用激动剂增加Nrf2 表达时，缺血脑组织的含水量减少，梗死体积缩小，证明 Nrf2 在脑缺血再灌注的损伤中具有保护作用,以及具有清除自由基的作用[9]。因此，探索激活细胞防御的保护性分子，包括天然产物中的保护性分子，即通过激活Nrf2 以防护紫外线诱导的氧化应激，为光老化的防治提供了新策略。由于表皮角质形成细胞经常暴露于紫外线照射，激活Nrf2 是人类皮肤细胞的有效保护的关键。在本次研究中，证实 UVB 辐射后，Western-blot 技术检测到HaCaT 细胞中 Nrf2 蛋白表达降低，同时，笔者的研究发现，稳定转染Nrf2-siRNA 基因的HaCaT 细胞，在Nrf2 蛋白表达降低的基础上，进行UVB（30 mJ/cm2）照射后继续培养24 h，倒置光学显微镜下观察 HaCaT 细胞与其他组比较，贴壁细胞明显减少，漂浮死亡的细胞增多，贴壁的细胞部分去正常的膜结构。CCK-8 法检测发现与 UVB 照射组及siRNA组对比，siRNA+UVB 组细胞活性是显著降低的。流式细胞仪检测HaCaT 细胞的ROS 荧光强度，发现稳定转染Nrf2-siRNA 基因的HaCaT 细胞的平均荧光强度明显高于正常组和UVB 组，在进行UVB（30 mJ/cm2）照射后，siRNA+UVB 组与siRNA 组比较，平均荧光强度增加2 倍左右，而UVB 组进行UVB（30 mJ/cm2） 照射后与正常组比较平均荧光强度增加1倍左右。本实验的研究结果表明，稳定转染Nrf2基因沉默表达的HaCaT 细胞，在UVB 照射后，细胞的损伤更严重，其机制可能与Nrf2基因 抗氧化应激通路密切相关。UVB 照射细胞诱发细胞损伤，除了Nrf2-ARE 通路，还有其他多种信号通路参与皮肤光老化的发生，如核因子κB（NF-κB）信号通路，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和磷脂酰肌醇-3 激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶——西罗莫司靶蛋白（PI3K-AKt-mTOR）信号通路[10]。

图3 各组HaCaT 细胞中ROS的平均荧光强度

图4 各组HaCaT细胞Nrf2蛋白的表达

综上所述，UVB 能造成体外培养的HaCaT 损伤，Nrf2基因在UVB 诱导的角质形成细胞的光损伤中具有保护作用。