莱菔硫烷减轻肾缺血再灌注大鼠肝损伤

何 炜 刘风藏 于国霞 王 磊△

（1 华北石油管理局总医院功能检查科，任丘 062552；2 河北医科大学解剖学教研室，石家庄 050017；3 石家庄市妇幼保健院药剂科，石家庄 050051）

肾缺血再灌注损伤（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）是手术治疗肾脏疾病过程中常见的病理生理现象[1]。肾在缺血及其后的血液再灌注过程中会有大量活性氧族（reactive oxygen species，ROS）产生，导致肾损伤。因此，氧化应激被认为是引发RIRI 的主要机制之一[2-3]。本课题组前期研究表明，RIRI 发生后，肝脏也会遭受过氧化损伤[4]。核因子NF-E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是抗氧化应激转录调控因子，可调节抗氧化蛋白的表达[5-6]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，SOD）是重要的抗氧化酶，可清除ROS，同时也是Nrf2 转录调控的靶基因之一[7]。莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）是Nrf2 通路的诱导剂，可上调Nrf2 及其靶基因，发挥抗氧化等生物学作用[8]。本研究给予RIRI 模型大鼠SFN，观察肝组织形态、功能、过氧化损伤及SOD 的表达变化，探讨SFN 在防治RIRI 诱发的肝损伤中的作用。

1 材料和方法

1.1 RIRI 模型的制备、分组和样品采集

24 只雄性Wistar 大鼠（200±10）g，随机分为对照组（Control 组）、RIRI 组、缺血+SFN 组（SFN1组），灌注+SFN 组（SFN2 组）。RIRI 组参照余晓东等[9]的方法建立RIRI 动物模型。腹腔注射6%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉大鼠，充分暴露双侧肾，切除右侧肾，无创动脉夹在靠近肾门处夹闭左侧肾动脉，阻断血供45 min 后弃去动脉夹，重新恢复左侧肾的血液供应。对照组大鼠切除右侧肾，并分离左侧肾动脉，但并不夹闭。SFN1 组大鼠在夹闭左侧肾动脉后立即将二甲基亚砜稀释的SNF 均匀涂抹于小肠表面，SFN2 组大鼠在弃去血管夹恢复血液灌注时立即将SNF 均匀涂抹于小肠表面，其余操作步骤同RIRI 组。对照组和RIRI 组只在小肠表面涂抹等量的二甲基亚砜。灌注24 h 后收集血液，3 000 r/min，离心10 min，收集血清用于谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）测定；4%多聚甲醛固定肝，用于H-E 染色观察大鼠肝形态学变化。其余肝置于液氮中，用于丙二醛（malondialdehyde，MDA）和H2O2含量，SOD 活性、SOD mRNA 和蛋白表达水平测定。

1.2 大鼠肝形态结构观察

H-E 染色观察肝组织形态结构：4%多聚甲醛固定肝组织，常规脱水、透明，石蜡包埋，切片厚度5 µm，脱蜡至水，H-E 染色，脱水、二甲苯透明2～5 min、中性树胶封片。光学显微镜下观察肝组织形态结构变化。

1.3 血清ALT 活性测定

采用微板法检测ALT 活性，检测过程按南京建成检测试剂盒说明书进行。

1.4 肝组织MDA 含量检测

冰冻肝组织按20 mg/100 μL的比例加入预冷生理盐水快速匀浆，匀浆液4 000 r/min，4℃离心 20 min，收集约150 μL上清液，按照1∶1的比例于上清液内加入150 μL生理盐水，即为10%肝组织匀浆，作为待测样本。匀浆液中MDA含量采用南京建成MDA测定试剂盒检测，以每克肝组织蛋白中所含MDA的量（mmol/g pro）代表肝匀浆MDA含量。

1.5 肝组织H2O2含量和SOD 活性测定

冰冻肝组织按重量体积比1∶9 加入预冷生理盐水，快速匀浆，匀浆液10 000 r/min，4℃离心10 min，收集上清即为10%肝组织匀浆。匀浆液中H2O2含量和SOD 活性均采用南京建成测定试剂盒检测，每克肝组织蛋白中所含H2O2的量（mmol/gpro）代表肝匀浆H2O2含量；每毫克样本蛋白所含的酶活性单位（U/mg pro）表示肝组织SOD 活性。

1.6 肝组织SOD mRNA 水平测定

采用RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。2 μg RNA反转录成模板cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参照，Real-time PCR测定SOD mRNA表达水平。

1.7 肝组织SOD 蛋白水平测定

免疫印迹法测定大鼠肝组织SOD 蛋白水平。大鼠肝组织匀浆，离心后取上清。电泳蛋白上样量为62 μg。经过转膜和封闭处理，PVDF 膜上加入SOD 抗体（购于Abcam 公司），室温静置过夜。再加入辣根过氧化物酶标记IgG 抗体（购于Zymed公司）。双色红外线成像系统拍照并进行图像分析，以SOD 与GAPDH 条带积分光密度值之比表示其蛋白含量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠肝组织形态结构改变

光镜下可见，对照组大鼠肝细胞大小均匀，围绕中央静脉排列成条索状，肝血窦大小均匀未见异常；RIRI 组大鼠肝细胞萎缩，体积变小，肝血窦扩张；SFN1 组大鼠肝细胞肿胀，体积增大，肝血窦被挤压变窄，偶可见空泡变性；SFN2 组大鼠部分肝细胞萎缩，肝血窦略有扩张，肝细胞内可见有大量空泡，数量多于SFN1 组（图1）。

图1 对照组（A）、RIRI 组（B）、SFN2 组（C）、SFN1 组（D）肝形态结构H-E 染色，标尺=50 μm，×400Fig1 Microstructure of the liver in the control group（A），RIRI group（B），SFN2 group（C）and SFN1 group（D），H-E staining，bar=50 μm，×400

2.2 血清ALT 活性改变

各组大鼠血清内ALT 活性分别为：对照组（86.35 ±12.22）U/L、RIRI 组（210.27±29.94）U/L、SFN2 组（161.71±21.75）U/L、SFN1组（132.75 ±20.51）U/L。与对照组相比，RIRI组、SFN2 组、SFN1 组ALT活性均明显升高（P＜0.05），SFN2 组和SFN1 组ALT 活性低于RIRI组（P＜0.05），SFN1 组又低于SFN2 组（P＜0.05）。

2.3 肝组织MDA、H2O2含量的改变

与对照组相比，RIRI 组、SFN2 组，SFN1 组大鼠肝组织MDA 和H2O2含量明显升高（P＜0.05），但SFN2 组和SFN1 组肝 组织MDA 和H2O2含量明显低于RIRI 组（P＜0.05），SFN1 组又低于SFN2 组（P＜0.05）（表1）。

2.4 肝组织SOD 活性改变

大鼠肝组织SOD 活性分别为：对照组（133.33±14.21）U/mg pro、RIRI 组（53.36±7.28）U/mg pro、SFN2 组（73.46±8.96）U/mg pro、SFN1 组（86.75 ±10.16）U/mg pro。与对 照组 相比，RIRI 组、SFN2 组、SFN1 组SOD 活性均降低（P＜0.05），SFN2 组和SFN1 组SOD 活性高于RIRI组（P＜0.05），SFN1组又高于SFN2组（P＜0.05）。

表1 肝MDA、H2O2 含量（n=6，±s，mmol/g pro）Tab1 MDA and H2O2 content in the liver（n=6，±s，mmol/g pro）

表1 肝MDA、H2O2 含量（n=6，±s，mmol/g pro）Tab1 MDA and H2O2 content in the liver（n=6，±s，mmol/g pro）

*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs RIRI group；△P＜0.05 vs SFN2 group

Group MDA H2O2 Control 42.08±6.35 55.49±8.75 RIRI 96.49±12.38*124.15±18.52*SFN2 68.86±9.15*# 96.09±12.14*#SFN1 54.62 ±9.57*#△ 75.00 ±11.14*#△

2.5 肝组织SOD 基因的表达改变

与对照组相比，RIRI组、SFN2组、SFN1组大鼠肝组织SOD mRNA表达水平均升高（P＜0.05）。SFN2组和SFN1组大鼠肝组织的SOD mRNA相对表达水平又高于RIRI组（P＜0.05），但SFN2组和SFN1组之间差异无统计学意义（P＞0.05，图2A）。

2.6 肝组织SOD 蛋白的表达改变

与对照组相比，RIRI 组、SFN2 组、SFN1 组大鼠肝组织SOD 蛋白表达水平均升高（P＜0.05）。SFN2 组和SFN1 组大鼠肝组织SOD 蛋白相对表达水平又高于RIRI 组（P＜0.05），但SFN2 组 和SFN1 组SOD 蛋白相对表达水平差异无统计学意义（P＞0.05，图2B）。

图2 肝SOD mRNA（A）和蛋白（B）的表达Fig2 Expression of SOD mRNA（A）and protein（B）in the liver

3 讨论

首先，本研究观察了肝组织形态结构和功能的改变。显微镜及ALT 结果显示：RIRI 组、SFN1组、SFN2 组3 组大鼠的肝组织结构和功能均已受损，且RIRI 组最为严重，SFN1 组损伤轻于SFN2 组。提示肾缺血再灌注导致了大鼠肝形态结构和功能严重受损，SFN 处理能明显改善肝组织结构，减轻肝功能损伤，且缺血后即刻给予SFN 的改善作用要优于再灌注后给予SFN。

其次，本研究检测了肝组织H2O2和MDA的含量。H2O2是引发过氧化损伤的一个主要因素[11]。以H2O2含量反映肝组织内的ROS 含量即氧化应激水平。MDA 是组织细胞发生过氧化损伤的标志物之一[12]。实验结果显示：RIRI 组、SFN1 组、SFN2组3 组大鼠肝组织内H2O2和MDA 含量均明显升高。说明在RIRI 发生时，肝也已发生氧化应激，遭受过氧化损伤，这与本课题组前期研究结果一致。SFN1 组和SFN2 组含量明显低于RIRI 组，SFN1 组又低于SFN2 组。说明在大鼠肝组织氧化应激水平和过氧化损伤程度上，RIRI 组最为严重，SFN1 组又轻于SFN2 组。此结果提示，SFN 处理明显降低了肝组织的ROS 含量，减轻了肝组织过氧化损伤的程度，并且缺血后即刻给予SFN 的抗氧化作用要比再灌注后给予强。

最后，本研究检测了肝组织SOD 的活性及表达变化。SOD 是机体内清除超氧阴离子的重要抗氧化酶[13-14]。SOD 活性结果显示，RIRI 组、SFN1组、SFN2 组3 组大鼠肝组织内SOD 活性均降低，SFN1 组 和SFN2 组SOD 活性要高于RIRI组，提 示SFN 处理减轻了肝组织SOD 活性的丧失，而SFN1组又高于SFN2 组，提示缺血后即刻给予SFN 的效果要优于再灌注后给药。笔者推测，RIRI 发生时，肝组织有大量ROS 产生，引发肝组织发生过氧化损伤，导致其SOD 活性降低，SFN 降低了肝组织ROS 的含量，从而减缓了SOD 活性的丧失，而SFN1 组要比SFN2 组效果更好，是因为SFN1 组的SFN 提早作用了45 min。

SOD表达变化结果显示，RIRI组SOD mRNA和蛋白表达水平均高于对照组，笔者推测，由于ROS堆积，机体反馈性上调SOD的表达导致其升高。SFN1组和SFN2组的SOD表达又高于RIRI组，这是SFN诱导Nrf2上调SOD表达所致。SFN1组和SFN2组SOD表达无差异，SOD表达变化没有与活性变化平行，推测SFN1组给药早，其SOD表达提前升高后降低了肝组织ROS的含量，从而提前减缓了SOD活性的丧失，因此SFN1组SOD活性比SFN2组高，给药24 h后2组SFN对SOD表达的影响作用已趋近相同，导致2组SOD表达水平无差异。

综上所述，RIRI发生后，SFN可上调肝组织SOD的表达，增强肝对ROS的清除作用，降低肝组织氧化应激水平和过氧化损伤程度，改善肝的形态结构和功能。并且缺血后即刻给予SFN处理对于肝组织的抗氧化保护作用要优于再灌注后给药。