核呼吸因子1抑制高糖环境下成骨细胞的凋亡和促炎症细胞因子分泌*

李 瑞 石婷婷 王 强 张永先

（中国人民解放军联勤保障部队第九六〇医院骨创伤外科，济南 250031）

糖尿病患者常发生糖尿病性骨病，主要表现为骨皮质变薄、纤维性骨炎、骨关节骨质疏松、骨质增生、软组织钙化，甚至于出现病理性骨折，可能由于高血糖和脂肪、蛋白质代谢紊乱而引起[1]。高血糖是导致糖尿病性骨病重要始发因素，高血糖破坏骨代谢的动态平衡，对成骨细胞和破骨细胞的代谢作用产生影响。成骨细胞的活力降低是导致糖尿病性骨病的主要原因[2]。因此，如何维持高糖环境下成骨细胞的活性，是降低糖尿病性骨病发生的重要方式。核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，NRF1）是CNC-bZIP 转录因子家族成员[3]，直接参与诱导细胞凋亡的发生。近年的研究证明NFR1 在骨代谢中也发挥重要作用。高糖环境下，成骨细胞的凋亡是糖尿病性骨病发生的重要过程，但是相关机制尚不明确。本研究拟通过观察高糖处理时成骨细胞NRF1 的表达，分析高糖环境下过表达NRF1对成骨细胞凋亡的影响，以期为糖尿病性骨病的研究提供新的治疗依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人hFOB 1.19细胞购于美国ATCC公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Flag-NRF1质粒为Raymond Deshaies教授赠予（Addgene 质粒编号为34707）[4]；LipofectamineTM2000转染试剂购于美国Invitrogen公司；兔抗NRF1抗体购于英国Abcam公司；β-actin一抗和HRP标记的二抗购自武汉博士德公司；BCA试剂盒、PVDF膜以及其他相关试剂均购于上海碧云天生物科技公司；ELISA检测试剂盒[肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）货号RTA00，白细胞介素1-β（interleukin-1β，IL-1β）货号RL B00；IL-6货号R6000B]购自美国R＆D Systems公司。

1.2 细胞培养和转染

人hFOB 1.19 细胞采用37 ℃含5% CO2细胞培养箱培养，DMEM 低糖培养基（葡萄糖5.5 mmol/L）内加入10%的胎牛血清和1%青霉素/链霉素。细胞密度达到80%时采用胰酶消化传代培养，细胞转染采用12 孔板培养，细胞密度达50%时，采用LipofectamineTM2000 按试剂使用说明转染Flag-NRF1 质粒和空白对照质粒，分别设为NRF1 组和空载体组。参照参考文献[5]，高糖培养基采用浓度为22.0 mmol/L。人hFOB 1.19 细胞和转染细胞（NRF1 组和空载体组）使用高糖培养基（高糖处理组）或者一般低糖培养基（低糖对照组）培养 7 d 后，分别检测蛋白表达、细胞凋亡和促炎症因子水平。

1.3 免疫印迹检测NRF1 蛋白表达

收集处理后细胞并加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，BCA 法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE、转膜、封闭后，采用兔抗人NRF1 抗体和小鼠抗人GAPDH 抗体（1∶1 000 稀释），4 ℃孵育16 h，洗涤后加入HRP 标记的羊抗鼠二抗（1∶3 000 稀释），37℃孵育1 h，采用ECL 发光试剂盒在凝胶成像仪采集图像。Image J 软件分析灰度值，获得相对蛋白浓度。

1.4 流式细胞术分析高糖处理后转染细胞凋亡比例

NRF1 组和空载体组的细胞经高糖处理7 d 后，离心收集全部细胞。PBS 洗涤后，使用Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒染色。使用BD FACS Calibur 流式细胞仪进行检测，检测数据使用FlowJo.7.6.1 软件（BD Biosciences）分析，每组实验均独立重复3 次。

1.5 ELISA 法检测细胞培养基中促炎细胞因子的水平

收集培养高糖处理7 d 后细胞的培养基，使用ELISA 试剂盒检测培养上清中的IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表达水平，用BIO-RAD Model 550 酶标仪测定结果，每组实验均独立重复3 次。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 高糖处理时成骨细胞NRF1 的表达

与低糖对照组（0.82±0.17）相比，高糖处理组的人hFOB 1.19 成骨细胞中NRF1 蛋白表达量显著降低（0.10±0.02，P＜0.05），提示高糖可抑制成骨细胞NRF1 的表达（图1）。

图1 免疫印迹检测成骨细胞NRF1 蛋白表达 Fig1 Expression of NRF1 protein in osteoblasts detected by Western blotting

2.2 成骨细胞转染NRF1 或者空载体

采用NRF1表达质粒转染hFOB 1.19细胞，上调NRF1表达水平，空载体质粒转染构建空载体组细胞。采用高糖处理转染细胞，免疫印迹检测结果显示，相比空载体组（0.12±0.07），NRF1质粒转染后hFOB 1.19细胞的NRF1蛋白表达水平显著升高（0.88±0.23，P＜0.05），证实NRF1模型制备成功。高糖处理后，NRF1组细胞NRF1表达水平（0.79±0.11）与hFOB 1.19低糖对照组细胞（对照组）水平差异无统计学意义（0.88±0.23，P＞0.05）（图2）。

图2 免疫印迹检测转染成骨细胞NRF1 蛋白表达Fig2 Expression of NRF1 protein in transfected osteoblasts detected by Western blotting

2.3 上调NRF1 表达对高糖环境下成骨细胞凋亡的影响

流式细胞检测显示，与空载体组比较，高糖处理后NRF1 组的成骨细胞凋亡率呈明显降低趋势，分别为35.52%±9.55%和14.05%±2.13%（P＜0.05）（图3）。

图3 流式细胞术检测各组成骨细胞凋亡率Fig3 Cell apoptosis rate of osteoblasts in each group detected by flow cytometry

2.4 NRF1 调控成骨细胞促炎症因子分泌

通过ELISA 法检测细胞培养基中促炎细胞因子的水平，结果表明，与空载体组相比，NRF1 组的成骨细胞中分泌的TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均显著降低（P＜0.05）（图4）。

图4 ELISA 法检测各组成骨细胞促炎症因子分泌水平Fig4 Levels of secreted pro-inflammatory factors in each group detected by ELISA assays

3 讨论

近年来糖尿病性骨病作为常见的代谢性疾病在发病率上呈明显上升趋势[6]。相关因素分析显示成骨细胞的功能障碍是重要机制之一。成骨细胞参与骨组织的矿化和重建，是骨代谢的关键功能细胞之一。成骨细胞发生功能障碍时，骨组织量显著减少，而骨吸收明显增加；同时成骨细胞的功能障碍会打破破骨与成骨过程的平衡，增加骨质疏松和骨折发生的风险[7]。通过维持成骨细胞的活性，可以改善糖尿病患者的骨代谢平衡，避免糖尿病性骨病的发生。

NRF1 在多种组织中均有表达，参与介导抗氧化反应，在细胞组织发育、分化等多种过程中发挥重要作用。胰岛β 细胞NRF1 的缺失可以导致血浆基础胰岛素水平升高，但在高糖刺激下，胰岛素分泌水平则显著下降[8]。在大样本人群调查中显示，NRF1 的表达水平与血清成骨细胞中的相关指标关系密切，呈正相关[9]。

本研究结果显示经高糖处理后，成骨细胞NRF1 表达水平明显下降。上调NRF1 的表达水平，高糖处理成骨细胞的凋亡率显著下降，提示NRF1参与成骨细胞在高糖环境下的生存维持。以往研究表明NRF1 通过调节线粒体细胞色素c 释放，直接参与调节细胞凋亡[10]。相关分子调控机制尚需要进一步的研究。

NRF1 作为转录因子，直接与靶基因启动子区域的抗氧化元件结合，实现在转录水平上对多种基因的表达调控。既往研究提出IL-1β 参与细胞凋亡的启动，活性转化的IL-1β 直接参与基质蛋白分解，并通过激活其他家族成员介导细胞凋亡[11]。IL-6影响多种细胞的增殖与分化，其高水平表达与细胞凋亡密切相关[12]。TNF-α 通过TNF 受体1 介导凋亡信号，促进细胞凋亡[13]。抑制促炎性细胞因子尤其是TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌，可能是NRF1 抑制成骨细胞凋亡的重要机制之一。本研究结果显示NRF1 上调表达后，成骨细胞分泌的IL-1β，IL-6 和TNF-α 细胞因子呈显著降低，可能是NRF1 抑制成骨细胞凋亡的机制之一。

NRF1 属于CNC-bZIP 蛋白家族，该家族存在多个家族成员，包括抗氧化反应核心调控因子Nrf2以 及Nrf3、NF-E2p45、Bach1、Bach2 等。此 外，Nrf1 通过基因上的不同启动子和mRNA 加工过程，从单一基因可产生多个转录本，并编码出不同属性和功能的蛋白亚型[14]。本研究过表达的NRF1 是全长NRF1 的转录本[14]。不同家族成员之间的相互作用，以及不同转录本之间的功能差异，还有待进一步研究。