血管内皮细胞生长因子及其受体2在慢性砷染毒大鼠睾丸中的表达及其意义*

戴研平 高晓勤

（1 贵州医科大学基础医学院病理学与病理生理学教研室，贵阳 550004；2 遵义医药高等专科学校 基础医学院，遵义 563006；3 岳阳市岳阳楼区人民医院，岳阳 414000）

砷能够对生殖系统造成损害。据统计中国已有超过300 万的高砷暴露人群[1-2]。长期饮高砷水能够损害真核细胞的染色体，并对其子代产生影响[3]。目前关于砷中毒的机制研究还不明确[4]。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体2（vascular endothelial growth factor recepector 2，VEGFR2）在睾丸组织中有表达，且可能与雄性生殖有关[5-7]。VEGF 能够促进血管生成，VEGFR2 即KDR 是血管发生和构建的主要调节者。VEGF/VEGFR-2（KDR）结合后会抗凋亡、促进内皮细胞增殖、提高血管通透性等[8-10]。已经明确长期砷暴露可影响人类的生殖和发育，但关于其生殖毒性具体机制还不明确[11-13]。本研究旨在通过血管生成的角度探讨慢性砷中毒对大鼠睾丸损伤的分子机制，为砷中毒引起男性不育的防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 动物分组及模型建立

健康清洁级雄性SD 大鼠40 只，体质量160～200 g，由贵州医科大学实验动物中心提供。大鼠随机分为高、中、低剂量砷酸毒组和对照组，每组10 只。用亚砷酸钠配制的水溶液进行染毒，高、中、低剂量砷酸毒组染毒剂量分别为：60、12、2.4 mg/L，对照组饮用蒸馏水，采用自由饮用方式进行连续染毒6月，建立慢性砷中毒大鼠的动物模型。

1.2 主要试剂

亚砷酸钠（分析纯，北京化工厂）；VEGF 和VEGFR2 兔抗鼠多克隆抗体（GeneTex 公司）；山羊抗兔IgG（北京中杉金桥有限公司）；TRIzol 提取试剂盒（Thermo Scientific 公司）；流式细胞试剂盒（BD 公司）。

1.3 H-E 染色观察各组大鼠睾丸组织一般结构的变化

每组随机选取3 只大鼠左侧睾丸制作石蜡切片，每组随机抽3 张切片，主要步骤如下：（1）切片常规脱蜡至水；（2）苏木精室温下染色约15 min，自来水冲洗；（3）酸乙醇脱色，氨乙醇蓝化；（4）室温下染伊红2～3 min；（5）上行脱水、透明；（6）中性树胶封片。

1.4 免疫荧光化学法对VEGF 和VEGFR2 的表达进行定位

每组随机选取3 只大鼠左侧睾丸组织石蜡切片化蜡下行至水,30 ml/L 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，山羊抗血清室温下封闭30 min，4 ℃孵育一抗（1∶100）过夜，次日在恢复室温下复温40 min后用FITC 标记的羊抗兔IgG（1∶500）在37 ℃孵育2 h，采用甘油-碳酸氢钠湿封剂封片。上述步骤均 在0.01 mmol/L PH（7.0～7.4）/L PBS 洗3 次，每次5 min。用荧光显微镜（OlympusBX51）拍照。

1.5 实时荧光定量PCR 法检测VEGF 和VEGFR2 的mRNA 表达水平

每组随机选取3 只大鼠右侧睾丸，抽取右侧睾丸总RNA 并测定浓度，逆转录为cDNA，在实时荧光定量PCR 中作为模板（表1）。采用SYBR Green I 荧光染料法在ABI 7900 定量PCR 仪器上进行。PCR 反应条件为：95 ℃预变性l0 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，40 个循环，GAPDH 为内参，检测各模板的Ct 值（C 代表cycle，T 代表threshold）。

表1 GAPDH、VEGF、VEGFR2 PCR 引物序列Tab1 PCR primers for GAPDH，VEGF and VEGFR2

1.6 流式细胞术检测精子凋亡

每组随机选取3 只大鼠右侧附睾，分离大鼠右侧附睾尾部，用眼科剪在附睾尾部剪一小口，用2 把眼科镊交替挤压，使精子流出，将精液放入预冷的PBS 液中洗涤离心2 次，每次5 min；重悬细胞用1×Binding Buffer 稀释精子浓度至1×106个/mL，用200 目尼龙纱布过滤；取100 μL 悬液于5 mL 的培养管；加入5 μL FIFC 和5 μL PI；轻轻重悬后置于暗盒中15 min；每管再加入400 μL 1×Binding Buffer，在1 h 之内上流式细胞仪检测细胞凋亡率，用FlowJo 软件分析结果。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

对照组大鼠进食饮水均正常，毛发有光泽，精神状态良好，无异常反应；与对照组相比，低剂量砷组体质量无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量砷组毛发粗糙，泛黄，精神萎靡，易激惹，体质量增长缓慢，差异有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量砷组的右侧睾丸质量与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量砷组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；各组脏器系数比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.2 各组大鼠睾丸组织病理学变化

光镜下，对照组睾丸组织生精小管上皮结构完整，细胞排列紧密，生精上皮细胞有5～7 层（图1A，见封二）。低剂量砷组生精小管上皮结构疏松，只有3～5 层细胞（图1B，见封二）。中剂量砷组可见生精小管间隙增宽，上皮结构疏松，排列层次紊乱，有2～4 层细胞，管腔中可见脱落的生精细胞（图1C，见封二）。高剂量砷组生精小管上皮细胞层次进一步减少，仅剩1～2 层，生精细胞出现空泡样改变。部分管腔中可见大量脱落的生精细胞（图1D，见封二）。

表2 各组大鼠体质量、右侧睾丸质量、脏器系数检测结果（n=10，±s）Tab2 Body weight，right testicular weight and viscera coefficient in each group（n=10，±s）

表2 各组大鼠体质量、右侧睾丸质量、脏器系数检测结果（n=10，±s）Tab2 Body weight，right testicular weight and viscera coefficient in each group（n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Body weight（g）Right testicular weight（g）Right viscera coefficient（%）Before infection After infection Control group 198.70±13.22 310.90±18.82 1.7030±0.0838 0.5480±0.0480 Low dose arsenic group 201.30±19.19 298.00±19.80 1.6360±0.0948 0.5500±0.0386 Middle dose arsenic group 196.80±16.53 279.30±24.92*1.5700±0.1065*0.5640±0.0460 High dose arsenic group 194.90±12.47 267.50±25.97*1.5530±0.1111*0.5870±0.0864

2.3 睾丸组织VEGF、VEGFR2 的表达情况

荧光显微镜观察结果显示，VEGF 和VEGFR2在大鼠睾丸中均有表达，VEGF 主要位于睾丸精原细胞和支持细胞的胞质及胞核、初级精母细胞及精子细胞的顶体和精子残余体。VEGFR2 位于精子细胞发育中的顶体、精原细胞及支持细胞的胞质及胞核、间质细胞的胞质和部分血管内皮及管壁平滑肌（图2，见封二）。

2.4 各组大鼠睾丸VEGF，VEGFR2 mRNA表达情况

与对照组比较，低、中、高剂量砷组VEGF mRNA（1.17±0.05、0.80±0.03、0.77±0.03比2.84±0.06）、VEGFR2 mRNA（0.92±0.06、0.69±0.04、0.56±0.02 比1.57±0.05）含量均较低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠精子凋亡率

流式细胞术结果显示，随着染毒剂量的增加，精子早期平均凋亡率逐渐增加。与对照组比较，低、中、高剂量砷组精子平均凋亡率（1.12±0.07、3.80±0.25、9.10±0.12 比0.99±0.08）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

砷中毒是引起男性不育的重要原因之一，但其具体机制还不清楚。慢性砷中毒可导致睾丸血流动力学改变，影响睾丸精子发生和附睾精子的成熟，甚至导致不育[14-15]。

砷可影响睾丸生精细胞导致精子质量下降[16]。生长因子在睾丸生精细胞的活动中起重要作用[17-18]。研究证明，VEGF与生精功能的调节有关[19]。本研究H-E染色结果显示，对照组睾丸组织生精上皮内生精细胞排列紧密，中、高剂量砷组部分生精小管的初级精母细胞层与精原细胞层之间发生分离，生精上皮细胞层数减少，排列稀疏，且间质不同程度地增宽，腔内精子数减少，这些均为生精障碍的表现。本研究显示砷中毒前，染毒组与对照组大鼠体质量比较无明显差别。砷染毒后，中、高剂量组大鼠体质量下降。随着染毒剂量的增加，睾丸质量逐渐下降，说明砷具有一定的抑制大鼠睾丸生长的作用。但各组右侧睾丸系数对比无明显差异，可能是大鼠的体质量下降或睾丸组织水肿导致的误差所致。以上结果提示，砷可损伤睾丸组织，引起睾丸萎缩，这可能是其导致睾丸质量减轻的一个原因。RT-PCR 结果示，与对照组相比，各染毒组VEGF 及VEGFR2 的表达水平下降，可能是砷损害了大鼠睾丸间质的血管通透性，进而影响VEGF 及VEGFR2 的表达所致。

外源性的化学物质可影响生精细胞的活动，导致精子活力下降[20]。研究表明，砷可通过血睾屏障损害男性生殖细胞[21]。VEGF 及VEGFR2 对精子顶体的发育具有重要作用。VEGF 能通过作用于其受体对男性生殖起调节作用[22]。精子是VEGF 的靶细胞之一。顶体位于精子头部，对男性的生育力有直接影响[23]。睾丸内精子发生受到生物因子的作用[24]。VEGF 是最强的血管通透因子，VEGFR2 是血管形成和生成的主要调节者。

本研究免疫荧光结果显示，睾丸血管内皮及小血管平滑肌上有VEGF 表达，笔者推测VEGF 可能以自分泌或旁分泌方式作用于睾丸间质毛细血管，调节睾丸微血管通透性和血管化[25]。VEGF 在支持细胞也有表达，它可通过旁分泌作用于生精细胞。免疫荧光结果还显示，VEGFR2 在精子顶体也有表达，与上述研究者的结果一致[26-27]。

砷中毒可引起凋亡[28-29]。本研究流式细胞术结果显示，与对照组比较，各染毒组大鼠精子凋亡率均升高。其原因可能为砷影响睾丸组织VEGF 及VEGFR2 的表达，这2 种因子共同作用于睾丸的血管系统，影响精子的发生和成熟。

总之，本研究结果说明慢性砷中毒时大鼠睾丸间质细胞和间质小血管发生改变，VEGF 和VEGFR2 的表达水平逐渐下降，而精子凋亡率升高。砷可能通过影响VEGF 和VEGFR2 的表达和睾丸间质细胞、血管间接改变精子发生、发育，进而共同影响男性生育力，但其具体机制有待进一步研究。

图1 各组大鼠睾丸组织病理学改变，×400。Fig1 Histopathological changes of testis in each group，×400.

图2 免疫荧光术检测大鼠睾丸VEGF，VEGFR2 的表达，标尺=100 μm。Fig2 Immunofluorescence technique was used to detect the expression of VEGF and VEGFR2 in rat testis，bar= 100 μm.